神经干细胞取自成年非冬眠期一年生北极地松鼠（AGS）的海马体。这些神经干细胞可通过多次传代进行扩增，并可分化并维持为神经元与胶质细胞比例接近50:50的培养体系。
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本文内容
摘要
摘要
北极地松鼠（Urocitellus parryii，AGS）在冬眠期间能够将核心体温降至接近或低于冰点，这一能力在动物中十分独特 1这些动物对脑缺血性损伤也具有抵抗能力 体内 2,3 氧糖剥夺 体外 4,5这些独特的特性促使研究人员分离出AGS神经元，以研究其内在的神经元特征，从而揭示AGS神经元能够抵抗缺血及极低温所致损伤和细胞死亡的潜在机制。鉴定赋予这些细胞独特性质的蛋白质或基因靶点，将有助于发现针对多种缺血性疾病的有效治疗策略，并推动耐寒机制的研究。成年AGS海马体中含有持续增殖的神经干细胞，使其在体外培养中易于扩增。本文描述了研究人员可利用这些干细胞及其分化神经元开展多种研究的方法。通过严格遵循这些操作步骤，AGS神经干细胞可连续传代两次或以上，并可分化为TUJ1阳性神经元比例较高（约50%）的培养体系，且无需使用有毒化学物质来抑制细胞增殖。缺血可诱导神经发生 6 并通过MEK/ERK和PI3K/Akt存活信号通路进行的神经发生有助于缺血耐受 体内7 和 体外 8 (凯勒赫-安德森，德鲁 等，正在准备中）。利用这些方法中的一种或多种，可从多个方面进一步表征这些独特的神经细胞。
方案
1. AGS 神经干细胞及培养基制备
- 成人北极地松鼠（Arctic ground squirrel, AGS）神经干细胞此前已通过所述方法分离9，现可作为冻存管形式商业化获得。细胞通过含干冰的隔热包装进行隔夜运输，以确保细胞保持在冻存状态。为维持细胞完整性，收到后应立即开箱，并储存于低于 -150°C 的环境或液氮杜瓦瓶的气相中。
- 通过向 95 mL agsNSC 基础培养基中加入 5 mL FBS（LS-1012），配制含 5% FBS 的 agsNSC 基础培养基。
- 通过向 50 mL agsNSC 基础培养基中加入 500 μL B-27 补充剂（Invitrogen），配制 agsNSC 扩增培养基。将剩余的 B27 分装为每份 1 mL 的等分试样，储存于 -20°C 直至使用。
- 将 25 mL 含 5% FBS 的 agsNSC 基础培养基和 20 mL agsNSC 扩增培养基置于 37°C 水浴中预热。
- 使用多聚-L-鸟氨酸包被用于扩增的培养瓶
- 解冻多聚-L-鸟氨酸（10 μg/mL）工作液。解冻后可在 2–8°C 条件下储存长达一个月。
- 向一个带透气盖的 T-75 培养瓶中加入 8 mL 多聚-L-鸟氨酸工作液，并将溶液均匀覆盖整个培养表面。（若使用其他培养容器，请相应调整工作液体积。每 10 cm2 培养面积使用 0.5–1.0 mL 多....
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讨论
AGS 成人神经干细胞具有很强的增殖能力，可进行多次传代扩增，是研究神经干细胞基本特性的优良细胞来源。其扩增速率约为每 24 小时倍增一次，但必须在细胞达到汇合前进行传代，因为细胞间的接触会促进其向星形胶质细胞分化。如果在胰酶消化和传代前已开始分化，接触介导的分化将导致神经元数量与总细胞数的比例显著下降。图 1 展示了一个应在 24 小时内进行传代的 AGS 神经干细胞培养物。
AGS 神经干细胞可牢固地黏附于聚-L-赖氨酸包被的 Biocoat 培养板，加入 1% 胎牛血清（FBS）90 分钟内细胞不会脱落。当去除 FBS 和重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGFbasic）后，细胞将分化为约一半神经元和一半星形胶质细胞。诱导后两周内，神经元将呈现 TUJ1 阳性（图 2），若使用 NeuraLife 培养基，则三周内呈现 MAP2 阳性。成熟神经元受体表达及功能的更全面表征尚在进行中。TUJ1 和 MAP2 的表达是神经前体细胞的特征，这些细胞已决定向神经元命运分化，但仍保留有丝分裂活性10。
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披露
J.A. Kelleher-Andersson 是 Neuronascent 的创始人，也是北极地松鼠专利申请的发明人。Neuronascent 可从 AGS 培养基和干细胞的销售中获得专利使用费。R.C. McGee 任职于 Lifeline, Inc.，该公司负责分销该培养基和 AGS 神经干细胞。
致谢
本研究由美国陆军医学研究与物资司令部资助项目（编号：05178001）以及国立神经疾病与卒中研究所资助项目 NS041069-06 支持。我们感谢 Joel Vonnahme 对本实验方案提出的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| agsNSC | Lifeline Cell Technology | FC-0004 | |
| agsNSC 扩增试剂盒 | Lifeline Cell Technology | LL-0008 | DMEM/F12、B27 和 rhFGFb 的替代来源（www.invitrogen.com） |
| agsNSC 分化试剂盒 | Lifeline Cell Technology | LL-0009 | DMEM/F12 和 ITS-x 的替代来源（www.invitrogen.com） |
| NeuraLife 维持培养基试剂盒 | Lifeline Cell Technology | LL-0012 | 替代来源包括 NeuraBasal（LifeLine）或 Neurobasal（Invitrogen）、谷氨酰胺和 B27（www.invitrogen.com）。分化后的细胞可在 NeuroLife 中维持培养长达 3 周，但在 Neurobasal 中不超过 2 周（www.invitrogen.com） |
| 显微计数板（如 Bright Line 计数室） | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm |
| BD 生物涂层多聚-L-赖氨酸包被的 96 孔板 | BD Biosciences | 356516 | www.bdbiosciences.com |
| 大孔径移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-141 | 可避免移液时对神经元细胞造成损伤。http://www.fishersci.com |
参考文献
- Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
- Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is res....
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