Summary
Cellule staminali neurali sono stati preparati da ippocampo di adulti non-letargo yearling scoiattoli artici (AGS). Queste cellule staminali neurali può essere espansa attraverso numerosi passaggi, differenziate e mantenuto come un neurone quasi 50:50 alla cultura gliali.
Abstract
Scoiattoli artici (Urocitellus parryii, AGS) sono unici nella loro capacità di letargo con una temperatura interna del corpo vicino o sotto lo zero 1. Questi animali anche resistere al danno ischemico cerebrale in vivo 2,3 e deprivazione di ossigeno e glucosio in vitro 4,5. Queste qualità uniche fornito l'impulso di isolare i neuroni AGS di esaminare le caratteristiche intrinseche dei neuroni che potrebbe spiegare la capacità dei neuroni AGS a resistere lesioni e la morte cellulare causata da ischemia e temperature estremamente fredde. L'identificazione delle proteine o obiettivi gene che consentono le proprietà distintive di queste cellule potrebbero essere di aiuto nella scoperta di terapie efficaci per una serie di indicazioni ischemica e per lo studio della resistenza al freddo. Adulto ippocampo AGS contiene cellule staminali neurali che continuano a proliferare, consentendo una facile espansione di queste cellule staminali in coltura. Descriviamo qui i metodi con cui i ricercatori possono utilizzare queste cellule staminali e neuroni differenziati per qualsiasi numero di scopi. Da seguire con attenzione questi passaggi il neurali cellule staminali AGS può essere espansa attraverso due o più passaggi e poi differenziato a una cultura ad alto contenuto di TUJ1-positivi neuroni (~ 50%) senza utilizzare sostanze chimiche tossiche per minimizzare il numero di cellule in divisione. Ischemia induce neurogenesi 6 e neurogenesi che procede attraverso MEK / ERK e percorsi di sopravvivenza PI3K/AKT segnalazione contribuisce alla resistenza ischemia in vivo in vitro 7 e 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., In preparazione). Un'ulteriore caratterizzazione di queste cellule neurali unica possibile anticipo su molti fronti, utilizzando alcuni o tutti questi metodi.
Protocol
1. AGS Neural Stem Cell e Media Preparazione
- Adulti dell'ippocampo scoiattolo di terra Artico (AGS), le cellule staminali neurali isolate in un modo descritto in precedenza 9 possono ora essere ottenuti commercialmente come fiale crioconservati. Le cellule sono pillole in confezioni isolati contenenti ghiaccio secco per assicurare che le cellule rimangono in uno stato crioconservati. Per mantenere l'integrità, decomprimere le cellule immediatamente dopo la ricezione e conservare a inferiore a -150 ° C, o in fase vapore di un Dewar di azoto liquido.
- Preparare agsNSC medio basale + 5% FBS FBS aggiungendo 5 ml (LS-1012) a 95 ml di mezzo agsNSC basale
- Preparare Media agsNSC di espansione con l'aggiunta di 500 microlitri B-27 Supplemento (Invitrogen) a 50 ml di mezzo agsNSC basale. Dividere il resto della B27 in 1 ml di aliquote e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Caldo 25 mL di agsNSC medio basale + 5% FBS e 20 ml di terreno di espansione agsNSC in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Fiaschi cappotto usato per l'espansione con poli-L-ornitina
- Scongelare il poli-L-ornitina (10 mg / ml) soluzione di lavoro. Conservare la soluzione tra 2-8 ° C fino a un mese, una volta scongelati.
- Aggiungere 8 ml di soluzione di poli-L-Ornitina lavorando ad uno sfogo T-75 pallone e distribuire uniformemente la soluzione su tutta la superficie intera cultura del pallone. (Definire la quantità di soluzione di lavoro per i pescherecci altra cultura che può essere utilizzato Usa 0.5 -.. 1,0 mL Poli-L-ornitina soluzione di lavoro per 10 cm 2 di superficie cultura)
- Incubare fiaschi a 37 ° C per un minimo di 24 ore. (L'uso di un incubatore senza aggiunta di CO 2 è preferibile per l'incubazione di Poly-L-ornitina recipienti di coltura rivestito.) Fiaschi rivestiti possono essere conservati per un massimo di due settimane in incubatrice.
- Prima dell'uso, aspirare Poli-L-ornitina soluzione di lavoro dal pallone e lavare due volte con acqua sterile colture di tessuti di qualità. Aspirare il liquido fino a quando il pallone è quasi asciutto prima dell'uso.
- Rimuovere una fiala dal Dewar e controllare che il tappo del flaconcino sia ben sigillato. Tenere la parte superiore del flaconcino lasciando la metà inferiore del flacone in un bagno d'acqua a 37 ° C per circa 60-90 secondi o fino a fiala è quasi completamente scongelati; una piccola quantità di ghiaccio dovrebbe essere ancora visibile. Per evitare potenziali contaminazioni, conservare il tappo del flacone fuori dall'acqua. Non più di disgelo, in quanto ciò potrebbe danneggiare le cellule.
- Spruzzare l'esterno del flaconcino con 70% di etanolo o isopropanolo, poi posto la fiala in un armadio di sicurezza biologica. Togliere il tappo con attenzione per evitare la contaminazione o splatter.
- Risospendere delicatamente le cellule nel flaconcino con l'aggiunta di 1 ml di agsNSC mezzi basale + 5% FBS usando una pipetta sterile. Trasferire la risospensione delle cellule a 25 mL di caldo Media agsNSC basale + 5% FBS in un tubo da 50 ml per centrifuga.
- Sciacquare la crio-fiala una volta con sospensione cellulare diluito. Centrifugare le cellule a 150 xg per 6 minuti. Per ottenere risultati ottimali, calcolare la velocità per ogni tipo di centrifuga individuo.
- Mentre le cellule girano verso il basso, aggiungere 10 ml di terreno di espansione agsNSC al secco poli-L-ornitina rivestito T-75 beuta e aggiungere 40 ml di rh FGF-base (40ng/mL). Dopo la centrifugazione, aspirare il liquido surnatante avendo cura di non aspirare il pellet. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di espansione agsNSC. Trasferire la ri-sospensione cellule in terreno di espansione agsNSC nei media nel T-75 pallone.
- Agitare delicatamente il recipiente di coltura da lato a lato per distribuire uniformemente le cellule all'interno del vaso.
- Cultura nave posto seminato a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Le cellule devono allegare al pallone e cominciano a formarsi i processi entro due ore dalla semina. Se le cellule rimangono galleggianti e appallottolato all'interno del mezzo, quindi centrifugare cellule in FBS 5% ed eseguire passi 1,8-1,10 con terreno fresco e pallone.
2. Ampliamento della AgsNSC
- Due giorni (~ 48 ore) dopo lo scongelamento e la semina delle cellule, una sostituzione medio completo dovrebbe essere eseguito utilizzando 20 ml di terreno di espansione agsNSC più un picco di 40 ml di rh FGF-base.
- Fiaschi Spike con 40 ml di rh FGF-base sul inoculazione giorno successivo. Le celle saranno pronti per trypsinize quando hanno raggiunto il 75-80% confluenza con il terzo o quarto giorno dopo l'inoculazione. Coltura le cellule staminali indifferenziate per più di 4 giorni dopo l'inoculazione non è raccomandato perché più incubazione consentono alle cellule di cominciare a differenziare di neuroni e neuroni possono essere ferito da tripsinizzazione durante la fase 3. Il rh FGF-base può essere conservato a 4 ° C per un massimo di una settimana e ancora mantenere l'attività. Il rh FGF-base può anche passare attraverso uno congelamento aggiuntivo / disgelo a -20 ° C se occorre più tempo.
3. Tripsinizzazione delle cellule
- agsNSC dovrebbero essere diversi passaggi 3 a 4 giorni dopo l'inoculazione. Preparare una poli-L-ornitina fiasco rivestito tra 24 ore e una settimana prima passaging se il agsNSC sarà ampliato di nuovo.
- Aspirare ilmedio dalla nave cultura. Aggiungere 2,5 ml di 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) per la nave per ogni cm 75 2 di superficie. Agitare delicatamente per garantire tutte le cellule sono rivestite con la tripsina / EDTA. Normalmente le cellule cominciano a staccarsi dalla superficie entro 60 secondi, a seconda della confluenza delle cellule. Non più di trypsinize, in quanto questo potrebbe danneggiare le cellule. Picchiettando delicatamente il recipiente di coltura da più lati incoraggerà distacco.
- Una volta che le cellule si staccano, aggiungere 10 ml di agsNSC medio basale + 5% FBS al pallone. Agitare delicatamente per assicurare tutta la soluzione tripsina viene neutralizzata. Utilizzando tecniche di laboratorio asettico, pipettare le cellule in una provetta sterile contenente 10 ml di agsNSC basale media +5% FBS. Ripetere lavando il pallone di nuovo con un ulteriore 10 ml di agsNSC medio basale + 5% FBS e si combinano con il primo lavaggio.
- Cellule Centrifugare a 150 xg per 6 minuti come descritto sopra. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero formare un ambiente pulito pellet sciolto. Aspirare tripsina e medie neutralizzato dalla provetta e risospendere il pellet cellulare in 10 ml (per T-75 fiasco) di pre-riscaldato a medio basale agsNSC + 5% FBS pipettando gentilmente su e giù 2X con una pipetta 10 ml. Eseguire un numero di celle come descritto di seguito.
4. Di calcolo standard per la placcatura di celle
- Utilizzando una tecnica asettica, agitare la sospensione cellulare e trasferire 15 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 15 ml di 0,4% Tricloroetano. Mescolare delicatamente e carico 10 ml di sospensione cellulare a ciascuna delle camere di un emocitometro pulito come una linea di colore conteggio Camera (catalogo # 1490: Hausser scientifico, http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
- Contare un minimo di 4 quadranti sul emocitometro. Le cellule blu che sono positivi per Tricloroetano sono morti e non devono essere conteggiati. Per la conta delle cellule preciso, il numero ottimale di cellule per quadrante dovrebbe essere 25-75 cellule.
- Dopo il conteggio delle cellule, calcolare la media dei 4 quadranti. Moltiplicare la media conta delle cellule da 10.000 e per il fattore di diluizione (2 se si utilizza il volume consigliato) per determinare il numero di cellule per ml. Si noti che se la vitalità percentuale totale è inferiore al 92% ci può essere un certo numero di cause. Una delle ragioni di vitalità basso può essere più tripsinizzazione, prima di tripsina neutralizzazione con FBS. Un altro motivo potrebbe essere che la concentrazione di siero (FBS) per tripsina è troppo bassa e le cellule continuano a essere trypsinized. In terzo luogo, le cellule potrebbero essere stati troppo confluenti, provocando le cellule staminali a differenziarsi a causa di contatto cellula-cellula, portando a lesioni durante tripsinizzazione. Se questo metodo viene seguito da vicino un rendimento di 3 o più raddoppi ci si può aspettare, dando una popolazione di> 4.000.000 cellule da un numero iniziale di circa 500.000.
5. Inoculazione di un altro pallone di espansione
- Per determinare il numero totale di cellule necessario per inoculare una nave, moltiplicare la densità di semina desiderata (6.600 cellule per cm 2 o 500.000 cellule per T-75 fiasco) per la superficie (in cm 2) della nave per essere inoculati. Se inoculando più di una nave moltiplicare il numero di cellule per nave per il numero totale di navi. Per determinare il volume (ml) di sospensione cellulare necessario per inoculare ciascuna nave, dividere il numero di cellule necessario per inoculare una nave per il numero di cellule vitali / mL nella sospensione cellulare. Se inoculando più di una nave calcolare il volume totale di sospensione cellulare necessari moltiplicando il volume necessario per una nave per il numero totale di navi da inoculare.
- Centrifugare il volume desiderato di cellule in agsNSC medio basale + 5% FBS, lasciando perdere pellet. Normalmente 500.000 cellule sono portati ad un volume totale di 25 mL in agsNSC medio basale +5% FBS come descritto in precedenza. Aspirare il liquido e risospendere il pellet sciolto in 10 ml di terreno di espansione agsNSC è richiesto Questo ulteriore fase di centrifugazione per rimuovere FBS prima dell'inoculazione. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato Media Expansion agsNSC al T-75 pallone. Aggiungere i 10 ml di sospensione cellulare risospeso per il T-75 Pallone poi aggiungere 40 ml di rh FGF-base al pallone. Si consideri che il tripsinizzazione e inoculazione non dovrebbe richiedere più di 1,5 ore per decidere il numero massimo di flaconi di lavorare con in qualsiasi momento. Si dovrebbe anche avere mezzi sufficienti per completare le modifiche dei media se si utilizza numerosi palloni.
- Scuotere delicatamente il pallone da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule e il luogo in recipienti di coltura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, come descritto in precedenza.
6. Diluizione delle cellule per l'inoculazione dei pozzetti per la differenziazione
- Qualsiasi multi-ben formato può essere utilizzato, ma inoculazione in BD Biocoat Poli-L-lisina rivestito Piastre a 96 pozzetti è described qui. Determinare il volume di sospensione cellulare necessari per l'esperimento moltiplicando il numero di pozzi di essere inoculato con 0,2 ml per bene per un multi-ben 96 piastra e aggiungere circa il 10% per coprire eventuali perdite di volume durante l'inoculazione. Calcolare la diluizione di una densità cellulare di 75.000 cellule / ml. Determinare la quantità di FBS da aggiungere alla media differenziazione per ottenere una concentrazione finale del 2% FBS (Tabella 1). Mescolare la FBS e medie differenziazione. Mescolare accuratamente le celle con il volume calcolato di media Differenziazione con FBS. (Nota: Durante la centrifugazione le cellule sono in agsNSC medio basale + 5% FBS FBS Mentre protegge le cellule durante la centrifugazione e facilita l'adesione delle cellule FBS inibisce differention Diluizione FBS al 2% consente l'adesione delle cellule alla superficie multi-bene... Il FBS 2% è poi ulteriormente diluita per promuovere la differenziazione. Insulin-transferrina-selenio (ITS-e) è incluso anche nel medio differenziazione di promuovere la differenziazione.
- In un armadio biosicurezza, dispensare 200 uL di sospensione cellulare diluito in un serbatoio Combitip sterile a ciascun pozzetto di una poli-L-lisina placca rivestita da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e suggerimenti orifizio di grandi dimensioni. Incubare le piastre per 1,5-2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Dopo che le cellule hanno attaccato, dopo circa 90 a 120 minuti, rimuovere con attenzione il 50% (100 microlitri per 96 pozzetti) del mezzo da ogni orifizio suggerimenti e di grandi dimensioni utilizzando pipetta. Ricollocare accuratamente il volume rimosso con acqua calda Media Differenziazione agsNSC, sempre con grande puntali orifizio. (L'uso di punte orifizio standard possono ferire le cellule).
- Due giorni dopo l'inoculazione (~ 48 ore), effettuare un cambio medio del 50% con medie agsNSC Differenziazione e grandi puntali orifizio.
7. Manutenzione di neuroni
- Preparare media neuronale manutenzione utilizzando NeuraLife, glutammina e B27 per le istruzioni. Media manutenzione neuronale deve essere preparata ogni settimana.
- Due giorni dopo l'ultima modifica agsNSC Media differenziazione, di solito 4 ° giorno dopo l'inoculazione, effettuare una sostituzione medio del 50% con medie di manutenzione neuronale.
- Continuare a svolgere sostituzioni medio del 50% con medie neuronale di manutenzione ogni 2 o 3 giorni. Processi neuronali dovrebbe apparire entro un paio di giorni di cambiare a medio manutenzione neuronale. Le cellule devono essere utilizzati entro 3 settimane di essere trasferito al terreno di mantenimento neuronale. I neuroni possono essere identificati con un numero di marcatori neuronali disponibili in commercio. Astrociti anche sempre essere osservate.
- Popolazioni di cultura tipicamente esprimono un rapporto superiore al 40% dei neuroni al numero totale delle cellule. L'uso di mezzi di manutenzione dei neuroni diversi NeuraLife possa fornire cellule inferiori che non guardano morfologicamente mature e non possono sopravvivere a lungo in coltura.
8. Rappresentante dei risultati:
Il suolo artico scoiattolo cellule staminali adulte neurali continueranno a raddoppiare ogni 24 ore per 3 a 5 giorni per almeno due passaggi quando seminate a 500,000-600,000 fiasco cells/75mm. Queste cellule si differenziano facilmente con la rimozione di basicFGF e B27 e la presenza di FBS 1-2% e 1% insulina / Transferrina / selenio, e diventerà TUJ1 (Covance) neuroni positiva entro 14-21 giorni (vedi Figura 2). Il rapporto tra i neuroni alle cellule totali in un range tra 40-60%, dipende dall'età della cultura (Figura 3). I neuroni possono essere utilizzati per la sperimentazione di 12 giorni post-semina con almeno 21 giorni dopo la semina.
Figura 1. Microfotografia di AGS adulto cellule staminali neurali dell'ippocampo.
Microfotografia fase di adulti AGS cellule staminali neurali dell'ippocampo dopo 3 giorni di crescita in agsNSC dei media basale in fiaschi rivestiti Poli-L-ornitina. Raddoppio avviene circa ogni 24 ore. Foto con ingrandimento 100X.
Figura 2. Micrografia fluorescente differenziate adulte AGS cellule staminali neurali dell'ippocampo
AGS cellule staminali neurali sono stati sottoposti a mezzi di differenziazione per 4 giorni, poi mantenuto nella Neuralife per 17 giorni in più prima della posa. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide 4% e neuroni identificati mediante TUJ1 anticorpo primario (Covance) e Alexa Fluor 568 anticorpo secondario (verde) da Invitrogen. Colorante Hoechst 33343 è stato aggiunto a macchia di tutti i nuclei (blu). Numero di cellulare, numero neurone e neurone rapporto sono stati determinati utilizzando il software neuriti escrescenza e lo strumento Arrayscan da Cellomics. Questa foto rappresenta circa il 57% dei neuroni. Ingrandimento 10X
Figura 3. Numero di neuroni e Ratio Neuron di AGS differenziate le cellule staminali neurali a trecultura età
AGS cellule staminali neurali sono stati sottoposti a mezzi di differenziazione per 4 giorni, poi mantenuto nella Neuralife per i giorni 12, 15 e 17 prima della posa. Le cellule sono state fissate e neuroni identificati con TUJ1 anticorpo primario (Covance). Hoechst colorante è stato aggiunto a macchia tutti i nuclei per l'identificazione delle cellule totali. Numero di cellulare, numero neurone e neurone rapporto percentuale sono stati determinati utilizzando il software neuriti escrescenza e lo strumento Arrayscan da Cellomics. Valori rappresentano media di 15 pozzi per condizione + SD.
Tabella 1. Esempi di calcolo utilizzato in passaging e semina
- Utilizzando 700.000 cellule / ml sospensione cellulare
- Utilizzando una densità cellulare di 75.000 cellule / ml o 15.000 cellule per pozzetto di 0,2 ml in ciascun pozzetto.
- Inoculando 96 pozzetti a 0,2 ml per pozzetto = 19,2 ml o desiderato volume finale 21 ml.
- (Volume finale x concentrazione finale) ÷ concentrazione iniziale = volume iniziale
(21 ml x 75.000 cellule / ml) ÷ 700000 = 2,25 ml - Volume di FBS in sospensione cellulare. 2,25 ml = 2,25 ml x 0,05 = 0,1125 mL
- Volume di FBS necessaria in 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml
- Volume di FBS da aggiungere a Media Differenziazione = 0,42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 mL
- Volume del mezzo di differenziazione = 21 ml - 2,25 ml di sospensione cellulare - 0,3075 ml 5% FBS = 18,44 ml.
- Combina 18,44 Media Differenziazione ml con FBS 0,308 ml e aggiungere 2,25 ml di sospensione cellulare.
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Discussion
AGS cellule staminali adulte neurali sono robusti e può essere ampliato per numerosi passaggi che li rende una fonte eccellente di cellule staminali neurali per lo studio delle proprietà delle cellule staminali neurali di base. Il tasso di espansione è di circa un raddoppio ogni 24 ore, ma queste cellule devono essere diversi passaggi prima di confluenza raggiungere perché il contatto tra le cellule favorirà la differenziazione di astrociti. Contatto mediato differenziazione quindi causa il rapporto tra i neuroni al numero totale di cellule di abbandonare drasticamente, se la differenziazione iniziata anteriormente al tripsinizzazione e passaggio. La figura 1 illustra un AGS staminali neurali colture cellulari che dovrebbero essere diversi passaggi entro 24 ore.
AGS cellule staminali neurali aderire fortemente alla poli-L-lisina Biocoat piastre rivestite e FBS può essere ridotta a 1% in 90 minuti senza il sollevamento cellule. Come FBS e rhFGFbasic vengono rimossi, le cellule si differenziano a circa mezzo neuroni e astrociti metà. I neuroni saranno TUJ1 positivo entro due settimane (Figura 2), e MAP2 positivo entro tre settimane post-induzione (se Media NeuraLife è utilizzato). Una caratterizzazione più completa espressione del recettore e la funzione dei neuroni maturi è in sospeso. TUJ1 e MAP2 espressione è caratteristica dei progenitori neuronali che si sono impegnati a un destino neuronale, ma conservano l'attività mitotica 10.
Risposta all'ipossia o glucosio deprivazione di ossigeno (OGD) cambia tra 2 e 3 settimane in coltura. Mentre, il numero di neuroni può diminuire dopo 16 giorni di coltura (4 giorni di differenziazione e di 12 giorni di manutenzione) la percentuale di neuroni alle cellule totale rimane vicino al 50% (Figura 3). Tuttavia, ipossia o OGD applicati a livello post semina 12-19 giorni può indurre neurogenesi in queste culture di neuroni che esprimono TUJ1. Indotto neurogenesi sembra essere un meccanismo attraverso il quale queste cellule resistono lesioni osservate in differenziate cellule staminali neurali esposti a insulti equivalente (in preparazione). Una migliore comprensione dei meccanismi di neurogenesi ipossia e OGD indotta in colture neuronali AGS potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di ictus, arresto cardiaco e demenza associata alla fornitura di sangue limitata.
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Disclosures
JA Kelleher-Andersson è il fondatore di Neuronascent ed è l'inventore delle applicazioni scoiattolo di terra di brevetto Artico. Neuronascent riceve royalties sulla vendita di AGS media e cellule staminali. RC McGee è un dipendente Lifeline, Inc. che distribuisce le cellule staminali neurali media e AGS.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla US Army Medical Research e Materiel Command concedere # 05178001 e NS041069-06 presso l'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo. Ringraziamo Joel Vonnahme per gli utili commenti sul protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agsNSC | Lifeline Cell Technology | FC-0004 | |
| agsNSC Expansion kit | Lifeline Cell Technology | LL-0008 | Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com) |
| agsNSC differentiation kit | Lifeline Cell Technology | LL-0009 | Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com) |
| NeuraLife maintenance media kit | Lifeline Cell Technology | LL-0012 | Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com) |
| Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm |
| Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates | BD Biosciences | 356516 | www.bdbiosciences.com |
| Large orifice pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-141 | Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com |
References
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