Summary
Нервные стволовые клетки были получены из гиппокампе взрослых незимоспящих годовалый суслики Арктики (АГС). Эти нервные стволовые клетки могут быть расширены с помощью многочисленных проходов, дифференцированной и поддерживается в виде почти 50:50 нейрона к глиальные культуры.
Abstract
Арктический суслики (Urocitellus parryii, AGS) являются уникальными в своей способности зимовать с внутренней температуры тела около или ниже нуля 1. Эти животные также сопротивляться ишемического повреждения мозга в естественных 2,3 и кислород-глюкозы лишения в пробирке 4,5. Эти уникальные качества послужил толчком для изоляции AGS нейронов изучить присущие нейронных характеристик, которые могли бы объяснить способность нейронов AGS противостоять травмам и гибели клеток вызванные ишемией и крайне низких температур. Выявление белков или генных целей, которые позволяют отличительные свойства этих клеток может помочь в обнаружении способов лечения ишемической число показаний и для изучения холоду. Взрослый AGS гиппокампе содержит нервные стволовые клетки, которые продолжают размножаться, что позволяет легко расширение этих стволовых клеток в культуре. Мы описываем здесь методы, которыми исследователи могут использовать эти стволовые клетки и дифференцированных нейронов для любого количества целей. По внимательно следит за этими шагами AGS нервные стволовые клетки могут быть расширены с помощью двух или более проходов, а затем к дифференцированной культуры высоко в TUJ1-положительных нейронов (~ 50%) без использования токсичных химических веществ, чтобы свести к минимуму количество делящихся клеток. Ишемия вызывает нейрогенез 6 и нейрогенез которая протекает через MEK / ERK и PI3K/Akt выживания сигнальных путей, способствует ишемии сопротивления в естественных 7 и в пробирке 8 (Келлехер-Андерсона, Дрю и соавт., В стадии подготовки). Дальнейшие характеристики этих уникальных нервных клеток может продвигаться по многим направлениям, используя некоторые или все из этих методов.
Protocol
1. AGS нейронных стволовых клеток и средства массовой информации подготовки
- Взрослый гиппокампа земли Арктики белка (AGS) нервные стволовые клетки изолированных таким образом, описанных выше 9 теперь могут быть получены в качестве коммерчески криоконсервированных ампул. Клетки погружены на ночь в изолированной упаковки, содержащие сухой лед для того, чтобы клетки остаются в криоконсервированных государства. Для поддержания целостности, распакуйте клетки сразу после получения и храните при температуре ниже -150 ° C, или в паровой фазе с жидким азотом сосуд Дьюара.
- Подготовка agsNSC базальной среды + 5% ЭТС, добавив 5 мл ФБС (LS-1012) до 95 мл agsNSC базальной среды
- Подготовка agsNSC Средний расширения путем добавления 500 мкл B-27 Дополнение (Invitrogen) до 50 мл agsNSC базальной среды. Разделить оставшуюся часть B27 в 1 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C до использования.
- Теплая 25 мл agsNSC базальной среды + 5% ЭТС и 20 мл agsNSC Средний расширения в 37 ° С водяной бане.
- Пальто колбах используется для расширения с поли-L-орнитин
- Оттепель поли-L-орнитин (10 мкг / мл) рабочего раствора. Хранить раствор при 2-8 ° С на срок до одного месяца раз разморозится.
- Добавить 8 мл поли-L-орнитин рабочего раствора на один вентилируемый Т-75 колбе и равномерно распределить раствор по всей поверхности культуры колбу. (Настраивается количество рабочего раствора для других судов культуры, которые могут быть использованы Использование 0.5 -.. 1,0 мл поли-L-орнитин рабочего раствора на 10 см 2 поверхности культуры)
- Инкубируйте колбы при 37 ° С в течение минимум 24 часов. (Использование инкубатор без добавления CO 2 является предпочтительным для инкубации поли-L-орнитин покрытием суда культуры.) Покрытием колбы может храниться до двух недель в инкубаторе.
- Перед использованием аспирата поли-L-орнитин рабочий раствор из колбы и мыть дважды стерильной культуре ткани класса воды. Аспирацию жидкости до колбу почти сухой перед использованием.
- Удалить из флакона Дьюара и убедитесь, что крышка флакона надежно запечатан. Держите верхнюю часть флакона оставив нижнюю половину флакона в 37 ° С водяной бане в течение примерно 60-90 секунд или пока флакон почти полностью оттаять; небольшое количество льда все равно должны быть видны. Чтобы избежать возможного загрязнения, держать флакон крышкой из воды. Не за оттепели, так как это может привести к повреждению клеток.
- Спрей внешности флакон с 70% этанола или изопропанола, затем поместить флакон в шкаф биологической безопасности. Снимите крышку, чтобы избежать загрязнения или брызг.
- Аккуратно повторно приостанавливать клетки во флаконе, добавляя 1 мл agsNSC Базальные СМИ + 5% ЭТС использованием стерильной пипетки. Передача ресуспендировали клетках до 25 мл теплой agsNSC базальной среды + 5% ЭТС в 50 мл центрифужную пробирку.
- Промыть крио-флакон сразу с разведенной суспензии клеток. Центрифуга клетки при 150 мкг в течение 6 минут. Для достижения наилучших результатов расчета скорости для каждого отдельного типа центрифуги.
- В то время как клетки вращаются вниз, добавьте 10 мл agsNSC Средний Экспансия на сухой поли-L-орнитин покрытием Т-75 колбу и добавляют 40 мкл влажности FGF-основной (40ng/mL). После центрифугирования аспирата надосадочной жидкости заботясь, чтобы не аспирата гранул. Повторное приостановить клеток в 10 мл среды Расширение agsNSC. Передача повторно приостановил клеток в agsNSC Средний Экспансия в СМИ в Т-75 колбу.
- Осторожно рок культуры судно из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки внутри судна.
- Место культуры посеяны судна в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора. Клетки должны приложить к колбе и начинают формировать процессы течение двух часов после посева. Если клетки оставаться на плаву и сжатой до в среде, то центрифуги клеток в 5% ЭТС и запустить шаги 1.8-1.10 свежей средой и колбы.
2. Расширение AgsNSC
- Через два дня (~ 48 часов) после оттаивания и посева клеток, полную замену среды должны быть выполнены с использованием 20 мл agsNSC Средний расширения плюс 40 мкл всплеск влажности FGF-основной.
- Спайк колбы с 40 мкл влажности FGF-основной на прививку следующий день. Клетки будут готовы trypsinize, когда они достигли 75-80% от слияния третий или четвертый день после прививки. Культивирование недифференцированные стволовые клетки дольше 4 дней после прививки не рекомендуется, так как обычно более инкубации позволит клетки начинают дифференцироваться в нейроны и нейроны могут пострадать от трипсинизации на шаге 3. Влажность FGF-основной можно хранить при температуре 4 ° С до одной недели и при этом сохранять активность. Влажность FGF-основной можете также пройти один дополнительный замораживания / оттаивания при температуре -20 ° С, если требуется больше времени.
3. Трипсинизации клеток
- agsNSC должны быть пассировали 3 до 4 дней после прививки. Подготовка поли-L-орнитин покрытием колбы в период с 24 часов, а за неделю до пассажей, если agsNSC будет расширена еще раз.
- Аспирируйтесреды из сосуда для культивирования. Добавить 2,5 мл 0,05% Trypsin/0.02% ЭДТА (CM-0017) на судно для каждого 75 см 2 площади поверхности. Swirl осторожно, чтобы гарантировать, что все клетки покрыты трипсин / ЭДТА. Клетки обычно начинают отделяться от поверхности в течение 60 секунд, в зависимости от слияния клеток. Не более trypsinize, так как это приведет к повреждению клеток. Осторожно нажав культуры судно с нескольких сторон будет способствовать отряда.
- Как только клетки отделяются, добавить 10 мл agsNSC базальной среды + 5% ЭТС в колбу. Аккуратно водоворот, чтобы гарантировать, что все решения трипсин нейтрализуется. Использование асептического лабораторные методы, пипетка клеток в стерильную пробирку центрифуги, содержащий 10 мл agsNSC базальной среды +5% FBS. Повторите промывкой колбу снова с дополнительными 10 мл agsNSC базальной среды + 5% ЭТС и смешать с первой стирки.
- Центрифуга клетки при 150 мкг в течение 6 минут, как описано выше. После центрифугирования клетки должны образовывать чистые свободные гранул. Аспирируйте нейтрализованы трипсина и среднего из центрифуги трубку и повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл (на Т-75 колбы) из подогретого agsNSC Средний Базальные + 5% ЭТС, осторожно пипетирования вверх и вниз 2X с пипеткой 10 мл. Выполнить подсчет клеток, как описано ниже.
4. Стандартный расчет для гальванических ячеек
- Использование асептики, вихрем суспензии клеток и передачи 15 мкл клеточной суспензии для микроцентрифужных трубки. Добавьте 15 мкл 0,4% Трипановый Blue. Осторожно перемешать и нагрузка 10 мкл клеточной суспензии для каждой из палат чистой hemacytometer таких как Яркие линии Счетной палаты (каталог # 1490: Хауссер Научные, http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
- Граф минимум 4 квадранта по hemacytometer. Синие клетки, которые являются положительными для Голубой Трипан мертвы и не должны учитываться. Для точного подсчета клетки, оптимальное число клеток в квадранте должна быть 25-75 клеток.
- После подсчета клеток, вычисления среднего арифметического 4 квадранта. Умножьте среднюю клеток на 10000, а также коэффициент разбавления (2 при использовании рекомендованных объемов) для определения количества клеток на мл. Заметим, что если общая жизнеспособность процент меньше, чем 92% может быть несколько причин. Одной из причин низкой жизнеспособности может быть более трипсинизации, до нейтрализации трипсина FBS. Другой причиной может быть то, что концентрация сыворотки (FBS), чтобы трипсина является слишком низким и клетки продолжают быть трипсином. В-третьих, клетки, возможно, были слишком сливающийся, в результате чего стволовые клетки дифференцироваться в связи с межклеточного контакта, что приводит к травмам во время трипсинизации. Если этот метод внимательно следил выход 3 или больше удвоений, как можно ожидать, что дает населению> 4000000 клетки от начального числа ~ 500,000.
5. Прививка Другой расширения Колба
- Чтобы определить общее количество клеток, необходимых для прививки одно судно, умножьте желаемую плотности посева (6600 клеток на см 2 или 500 000 клеток на Т-75 колбы) на площадь поверхности (в см 2) судна для прививки. Если прививки больше одного судна умножить количество ячеек на судно, на общее количество судов. Чтобы определить объем (мл) суспензии клеток необходимо привить каждому судну, разделите количество клеток, необходимых для прививки одного судна на количество жизнеспособных клеток / мл клеточной суспензии. Если прививки больше одного судна, расчет общего объема клеточной суспензии необходимо путем умножения объема необходимого для одного судна на общее количество судов для прививки.
- Центрифуга желаемого объема клеток в agsNSC базальной среды + 5% ЭТС, оставляя свободные гранул. Обычно 500000 клеток были доведены до общего объема 25 мл в agsNSC базальной среды +5% FBS, как описано выше. Аспирацию жидкости и вновь приостановить свободную гранул в 10 мл agsNSC Средний Расширение Этот дополнительный шаг центрифугирования, необходимой для удаления ФБС до прививки. Добавьте 10 мл подогретого agsNSC Средний Экспансия на Т-75 колбу. Добавить 10 мл суспензии клеток ресуспендировали к Т-75 колбу затем добавить 40 мкл влажности FGF-основной в колбу. Считайте, что трипсинизации и прививка должна занимать не более 1,5 часов при принятии решения максимального количества колб для работы с в любой момент времени. Следует также иметь достаточно средств массовой информации для полной смены носителя при использовании многочисленных колб.
- Осторожно колбу из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки и место культуры сосудов в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, как описано выше.
6. Разбавление Клетки для Прививка Ну Пластины для дифференциации
- Любой мульти-и формат может быть использован, но прививки в BD Biocoat поли-L-лизин покрытием 96-луночных является деописанный здесь. Определить объем суспензии клеток, необходимых для вашего эксперимента путем умножения количества скважин быть защищен на 0,2 мл на лунку для нескольких 96-луночного планшета и добавляем примерно 10%, чтобы покрыть любые потери объема при прививки. Расчет разбавления до плотности клеток 75 000 клеток / мл. Определить количество FBS которые будут добавлены к дифференциации среднего до достижения конечной концентрации 2% ЭТС (табл. 1). Смешайте FBS и дифференциация среды. Тщательно перемешайте клеток с расчетного объема Дифференциация среде с FBS. (Обратите внимание: во время центрифугирования клетки находятся в agsNSC базальной среды + 5% ЭТС Хотя FBS защищает клетки во время центрифугирования и способствует клеточной адгезии FBS тормозит дифференциация Разбавление ФБС до 2% позволит адгезии клеток к мульти-и поверхности... 2% ЭТС затем разбавляют оказывать дальнейшее содействие дифференциации. Инсулин-трансферрина-селен (ИТС-е) также входит в Дифференциация среднего способствовать дифференциации.
- В кабинете биобезопасности, обойтись 200 мкл разведенной суспензии клеток из стерильной водохранилище combitip в каждую лунку поли-L-лизин покрытием 96-луночного планшета использовании многоканальных пипеток и большие советы отверстия. Инкубируйте пластин в течение 1,5-2 часов при 37 ° C, 5% СО 2. После клетки придают, после примерно 90 до 120 минут, осторожно снимите 50% (100 мкл для 96-луночного) среды из каждой лунки с помощью больших советы пипетки отверстия. Тщательно заменить удаленный объем теплой agsNSC Средний Дифференциация, опять же с помощью больших советы пипетки отверстия. (Использование стандартных советов отверстие может повредить клетки).
- Через два дня после прививки (~ 48 часов), выполнить 50% средний изменение через agsNSC Средний Дифференциация и большие советы пипетки отверстия.
7. Поддержание Нейроны
- Подготовка нейронов среднего обслуживание с использованием NeuraLife, глютамина и B27 в соответствии с инструкциями. Нейронов среднего технического обслуживания должны быть готовы еженедельно.
- Через два дня после последнего agsNSC изменение среднего дифференциация, как правило, 4-й день после инокуляции, выполняют 50% средний замены использованием нейронных Средний обслуживание.
- Продолжайте выполнять 50% средний замены использованием нейронных Средний Техническое обслуживание через каждые 2 до 3 дней. Нейронные процессы должны появиться в течение нескольких дней после перехода на нейронов среднего технического обслуживания. Клетки должны быть использованы в течение 3 недель с момента передается нейронов среднего технического обслуживания. Нейроны могут быть идентифицированы с помощью ряда коммерчески доступных нейронных маркеров. Астроциты также всегда быть соблюдены.
- Культуры населения обычно выражают более 40% соотношение нейронов к общему числу клеток. Использование нейронных обслуживания средств массовой информации, не может обеспечить NeuraLife уступает клетки, которые не выглядят морфологически зрелые и могут не дожить до тех пор в культуре.
8. Представитель Результаты:
Земли Арктики белки взрослых нервных стволовых клеток будет продолжать удваиваться каждые 24 часов от 3 до 5 дней, по крайней мере два места, когда посеяны на 500,000-600,000 cells/75mm колбу. Эти клетки легко дифференцировать с удалением basicFGF и B27 и наличие 1-2% FBS и 1% инсулина / трансферрина / Селен, и станет TUJ1 (Covance) положительных нейронов в течение 14-21 дней (см. Рисунок 2). Отношение нейронов общего числа клеток будет колебаться между 40-60%, в зависимости от возраста культуры (рис. 3). Нейроны могут быть использованы для экспериментов с 12 дней после посева по крайней мере через 21 дней после посева.
Рисунок 1. Микрофотография АГС взрослых гиппокампа нервные стволовые клетки.
Фазы микрофотография АГС взрослых гиппокампа нервные стволовые клетки следующих 3-х дней роста agsNSC базальной СМИ в поли-L-орнитин покрытием колбы. Удвоение происходит приблизительно каждые 24 часов. Фотография на 100X увеличении.
Рисунок 2. Флуоресцентные микрофотографии дифференцированных взрослых AGS гиппокампа нервные стволовые клетки
AGS клетки нейронных стволовых подверглись дифференциации средств массовой информации в течение 4 дней, затем выдерживают в течение 17 Neuralife более дней до фиксации. Клетки фиксировали 4% параформальдегида и нейронов идентифицируются с помощью TUJ1 первичных антител (Covance) и Alexa Fluor 568 вторичными антителами (зеленый) от Invitrogen. Hoechst краситель 33343 был добавлен в пятно все ядра (синий). Сотовый номер, число нейронов и нейронных отношения определялись с помощью аксонов программного обеспечения продукт и инструмент из Arrayscan Cellomics. Эта фотография представляет собой примерно 57% нейронов. 10-кратным увеличением
Рисунок 3. Нейрон номера и Нейрон Отношение Дифференцированные AGS нервные стволовые клетки в трехкультуры возрастов
AGS клетки нейронных стволовых подверглись дифференциации средств массовой информации в течение 4 дней, затем сохраняется в Neuralife в течение 12, 15 и 17 дней до фиксации. Клетки были зафиксированы и нейронов отождествляется с TUJ1 первичных антител (Covance). Hoechst краситель был добавлен в пятно всех ядер для общей идентификации клеток. Сотовый номер нейрона количество и соотношение процентов нейронов определяли с помощью аксонов программного обеспечения продукт и инструмент из Arrayscan Cellomics. Значения представляют собой среднее из 15 скважин в состояние + SD.
Таблица 1. Примеры расчетов, используемых в пассажей и посева
- Использование 700 000 клеток / мл клеточной суспензии
- Использование сотового плотностью 75000 клеток / мл или 15 000 клеток на лунку в объеме 0,2 мл в каждую лунку.
- Прививании 96 скважин на 0,2 мл на лунку = 19,2 мл или желаемого конечного объема 21 мл.
- (Конечная концентрация х конечного объема) ÷ = начальная концентрация исходного объема
(21 мл х 75 000 клеток / мл) ÷ 700 000 = 2,25 мл - Объем FBS в клеточной суспензии. 2,25 мл = 2,25 мл х 0,05 = 0,1125 мл
- Объем ФБС необходимы в 21 мл = 21 мл х 0,02 = 0,42 мл
- Объем ФБС, чтобы добавить к дифференциации среднего = 0,42 мл - 0,1125 мл = 0,3075 мл
- Объем Дифференциация среднего = 21 мл - 2,25 мл клеточной суспензии - 0,3075 мл 5% FBS = 18,44 мл.
- Комбинат 18,44 мл Дифференциация среде с 0,308 мл ФБС и добавить 2,25 мл клеточной суспензии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
АГС взрослых нервных стволовых клеток являются надежными и может быть расширена за многочисленные проходы что делает их прекрасным источником нервных стволовых клеток для изучения основных свойств нейронных стволовых клеток. Скорости расширения составляет примерно удваивается каждые двадцать четыре часа, но эти клетки должны быть пассировать до достижения слияния, поскольку контакт между клетками будет способствовать дифференциации астроцитов. Контакт-опосредованной дифференциации, следовательно, причиной соотношение нейронов общего числа клеток с резко падать, если дифференциация начинается до трипсинизации и проход. На рисунке 1 показано стволовых AGS нейронных клеточных культур, которые должны быть пассировать в течение 24 часов.
AGS клетки нейронных стволовых придерживаться сильно поли-L-лизин пластинками, покрытыми Biocoat и ФПС может быть уменьшена до 1% в течение 90 минут без подъема клеток. Как FBS и rhFGFbasic удаляются, клетки дифференцироваться в нейроны, около половины, а половина астроцитов. Нейроны будут TUJ1 положительное в течение двух недель (рис. 2), а MAP2 положительное в течение трех недель после индукции (если NeuraLife Средний используется). Более полную характеристику экспрессии рецептора и функции зрелых нейронов находится на рассмотрении. TUJ1 и MAP2 выражение характерно нейронов прародителей, которые привержены нейронов судьбой, но сохраняют митотическую активность 10.
Ответ на гипоксии или кислорода глюкоза депривации (OGD) изменяется от 2 до 3 недель в культуре. В то время как количество нейронов может уменьшиться следующих 16 дней культивирования (4 дня дифференциации и 12 дней обслуживания) процент нейронов к общему клеток остается около 50% (рис. 3). Тем не менее, гипоксии или OGD применяется при посеве сообщение от 12 до 19 дней может вызвать нейрогенез в этих культурах TUJ1 выражения нейронов. Индуцированные нейрогенез, как представляется, одним из механизмов, с помощью которых эти клетки сопротивляются травм наблюдается в дифференцированных человеческих нервных стволовых клеток подвергается оскорблениям эквивалент (в стадии подготовки). Более глубокое понимание механизмов гипоксии и OGD вызванных нейрогенез в AGS нейронных культур может привести к разработке новых видов лечения для лечения инсульта, остановки сердца и деменции, связанные с ограниченным кровоснабжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JA-Келлехер Андерссон является основателем Neuronascent и изобретателя на земле Арктики приложений белка патента. Neuronascent получает роялти от продажи AGS СМИ и стволовых клеток. RC McGee работает на Lifeline, Inc, который распределяет средства массовой информации и AGS нервные стволовые клетки.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американской армии медицинских исследований и материально-командной грант № 05178001 и NS041069-06 из Национального института неврологических заболеваний и инсульта. Мы благодарим Джоэл Vonnahme за полезные замечания на протокол.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agsNSC | Lifeline Cell Technology | FC-0004 | |
| agsNSC Expansion kit | Lifeline Cell Technology | LL-0008 | Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com) |
| agsNSC differentiation kit | Lifeline Cell Technology | LL-0009 | Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com) |
| NeuraLife maintenance media kit | Lifeline Cell Technology | LL-0012 | Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com) |
| Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm |
| Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates | BD Biosciences | 356516 | www.bdbiosciences.com |
| Large orifice pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-141 | Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com |
References
- Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
- Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
- Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
- Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
- Christian, S. L. Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).
- Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
- Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
- Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).
