Summary
एक बार एक जीन संभावित मलेरिया के लिए आग रोक के रूप में पहचान की है, यह मच्छर के भीतर प्लाज्मोडियम संक्रमण को रोकने में अपनी भूमिका के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे मच्छरों के प्लाज़्मोडियम संक्रमण की हद तक assayed किया जा सकता है. gametocyte संस्कृति, झिल्ली खिला मच्छरों मानव रक्त की तैयारी, और मच्छर midgut में वायरल titers परख करने की क्रिया के लिए तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं.
Abstract
एक बार एक जीन संभावित मलेरिया के लिए आग रोक के रूप में पहचान की है, यह मच्छर के भीतर प्लाज्मोडियम संक्रमण को रोकने में अपनी भूमिका के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे मच्छरों के प्लाज़्मोडियम संक्रमण की हद तक assayed किया जा सकता है. gametocyte संस्कृति, झिल्ली खिला मच्छरों मानव रक्त की तैयारी, और मच्छर midgut में वायरल titers परख करने की क्रिया के लिए तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं.
Protocol
Gametocyte संस्कृति के ए तैयार:
- ताजा मानव रक्त और एक पानी के स्नान में 37 ओ सी सीरम लाओ.
- बाँझ शर्तों के तहत, एक Eppendorf ट्यूब में गर्म खून की एक एमएल pipet धूआं डाकू, में. एक अपकेंद्रित्र में 2200 rpm पर 5 मिनट के लिए रक्त स्पिन. एरिथ्रोसाइट्स pelleted होना चाहिए, हटाने और स्पष्ट सीरम त्यागें. नए सीरम तीन बार के एक समान मात्रा के साथ erythocytes धो gametocytes के लिए पूरे रक्त प्राप्त है.
- सीओ 2 इनक्यूबेटर या मोमबत्ती जार से gametocyte संस्कृति निकालें. इस संस्कृति RPMI मीडिया और खिलाया पर संस्कृति के 16 दिन पर मच्छरों को बनाए रखा जाना चाहिए. Gametocytemia% (संस्कृति के 16 दिन पर) निर्धारित करने के लिए एक बूंद रक्त के साथ एक गिलास स्लाइड पर एक पतली धब्बा बनाने के लिए और एक Geimsa दाग प्रदर्शन. परजीवी संस्कृति के क्षेत्र में gametes की संख्या का निर्धारण करते हैं. यह 2 की रेंज में आम तौर पर होता है - 4%. पूरे रक्त की मात्रा है कि आप वांछित अंतिम% gametocytemia (0.3 -1%) प्राप्त करने की आवश्यकता होगी गणना.
- Pipet का उपयोग कर अपनी gametocyte संस्कृति से मीडिया के सबसे निकालें, ध्यान लेने के लिए परेशान नहीं या परजीवी चूसना (परजीवी के रूप में काला दिखाई जबकि मीडिया प्रकाश गुलाबी लाल / होगा). Pipet एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में मीडिया और परजीवी के बाकी. 2200 rpm पर 5 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र में स्पिन. परजीवियों और एरिथ्रोसाइट्स गोली, निकालना होगा, और परेशान परजीवी के बिना सतह पर तैरनेवाला मीडिया त्यागें.
- तैयार पूरे रक्त की मात्रा (कदम A2 से) के साथ परजीवी का मिश्रण करने के लिए आप वांछित पिछले गणना के अनुसार अंतिम gametocytemia दे. मिश्रण अच्छी तरह से Pipet. (~ 1 मिनट)
यह अब नमूना आप अपनी मच्छरों को खिलाऊँगी है. एक पानी स्नान में 37 ओ सी में रखें.
बी दूध पिलाने मच्छरों:
- मोम लाइन गत्ता जाल एक रबर बैंड या गत्ते कप के साथ आपूर्ति ढक्कन द्वारा सुरक्षित जाल के साथ कवर कप में अपने एनोफ़ेलीज़ मच्छरों (~ 3-50) रखो . हम इस कदम के लिए एक बैटरी संचालित Aspirator का उपयोग करें.
- रबड़ ट्यूबिंग कांच के भक्षण के दोनों ओर नलिका डालने से परिसंचरण पानी स्नान तैयार. कई फीडर के रूप में कनेक्ट के रूप में आप एक श्रृंखला में की जरूरत है, इस श्रृंखला के एक छोर टयूबिंग द्वारा पानी के स्नान (हिस्सा है कि भक्षण के माध्यम से पानी धक्का) के फैलानेवाला के लिए जोड़ा जाना चाहिए, इस श्रृंखला के दूसरे छोर रबर टयूबिंग से मिलकर चाहिए स्नान में जलमग्न परिचालित पानी वापस स्नान में खाली करने के लिए अनुमति देते हैं. स्नान पर मुड़ें जब तक पानी के बारे में 37 ओ सी और पानी भक्षण के माध्यम से घूम रहा है और स्नान करने के लिए वापस. यह खून गर्म रखने और परजीवी को जीवित रखने के के लिए आवश्यक है.
- कांच झिल्ली फीडर के आसपास खींच, फीडर खोलने के लिए दबाव कसकर सील का उपयोग करके झिल्ली (हम बढ़ाकर parafilm के छोटे वर्गों का उपयोग करें) तैयार करें. यह झिल्ली त्वचा नकल करेंगे.
- एक झिल्ली साइड प्रत्येक मच्छर कप और सुरक्षित clamps या टेप का उपयोग भक्षण पर फीडर नीचे प्लेस. झिल्ली नेट के साथ फ्लश बैठकर ताकि मच्छरों कप अंदर से उपयोग कर सकते हैं चाहिए.
- फीडर की गर्दन में ध्यान विंदुक परजीवी खून (कदम A5 से), भोजन, सुनिश्चित करें कि रक्त गर्दन के माध्यम से जलाशय में सभी तरह से चला जाता है, ताकि मच्छरों रक्त का उपयोग कर सकते हैं झिल्ली संपर्क बना रही है. हम फीडर प्रति रक्त की 200 μl के बारे में उपयोग करते हैं, लेकिन यह भिन्न हो सकते हैं.
- मच्छरों को फ़ीड करने के लिए अनुमति दें. हम ≈ 30 मिनट के लिए उन्हें खिलाने के लिए अनुमति देते हैं (चर theexperiment पर निर्भर करता है, ज्यादातर प्रयोगों के लिए, कभी कभी निगरानी कितने पहले से ही पेट में रक्त की सामग्री को देख द्वारा एक भोजन ले लिया है.)
- खिलाने के बाद, मच्छर कप से भक्षण हटायें. पानी से स्नान करें और टयूबिंग से भक्षण डिस्कनेक्ट.
- झिल्ली निकालें और 10% ब्लीच को शुद्ध करना और पानी से कुल्ला में सोख भक्षण. प्लेस एक छोटे से biohazard बैग और एक बड़े biohazard गोदाम में जमा सामग्री में (झिल्ली, कागज तौलिए, दस्ताने, आदि) दूषित है.
- रेफ्रिजरेटर या ठंडे कमरे में कप रखकर मच्छरों anesthetize. एक बार पूरी तरह से मच्छरों anesthetized हैं, उन्हें एक पेट्री डिश पर एक बर्फ बाल्टी में एम्बेडेड हस्तांतरण. क्रमबद्ध करें मच्छरों, एक रक्त भोजन के किसी भी हस्ताक्षर के लिए पेट पर ध्यान से देख, और उन है कि फ़ीड नहीं था त्यागें. कुछ मच्छरों पूरी तरह से हो सकता है जबकि दूसरों को किया जाता खून की एक संकीर्ण बैंड दिखाएगा engorged जाएगा, सभी "के रूप में खिलाया" स्वीकार्य हैं. खिलाया मच्छरों गत्ता कप में वापस रखो.
- मच्छरों के लिए एक चीनी भोजन (10% sucrose में भिगो कपास का एक टुकड़ा) प्रदान करें, और 7 दिनों के लिए सामान्य insectary शर्तों के तहत सेते हैं. हर दिन, मच्छरों मृत्यु दर के लिए निगरानी की जानी चाहिए. इसके अलावा, कपास sucrose के साथ गीला किया जाना चाहिए, ताकि वे भोजन के वंचित नहीं कर रहे हैं. यह बेहतर है, अभी तक, एक कागज आसुत पानी में भिगो तौलिया जोड़ने के लिए, मच्छरों को नम रखने के. इन मच्छरों पी. falcipraum संक्रमित है, तो सभी ख्याल रखा ताकि कोई मच्छरों एस्केप कर सकते हैं चाहिएकप से ई. यह सबसे अच्छा है एक छोटे cagefor डबल संरक्षण में कप डाल.
सी. मच्छर midguts विदारक और oocyst भार का आकलन:
- गत्ता कप से एक बैटरी चालित Aspirator का उपयोग Aspirate मच्छरों (कदम B से). Anesthetize मच्छरों, जो हटाने योग्य Aspirator जलाशय अंदर हैं, एक ठंडे कमरे में जाने या बर्फ में कम से कम 5 मिनट के लिए जलाशय या मच्छरों रोक चलती जब तक दफन द्वारा.
- जलाशय से एक गिलास पेट्री बर्फ में एम्बेडेड पकवान anesthetized मच्छरों स्थानांतरण. एक एकल परत करने के लिए मच्छरों बिखरा हुआ है और एक प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर. मच्छरों कि पकवान पर नहीं ठहराया जा सकता जलाशय है, जो ठंडे कमरे या बर्फ में लौट रहा है में रहते हैं.
- ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, पकवान से 100 उल पीबीएस एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे घुड़सवार एक गिलास स्लाइड पर निहित एक एकल मच्छर हस्तांतरण. ठंडा पेट्री डिश में कवर दूसरों छोड़ो.
- ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, छाती और पीछे पेट में मच्छरों को पकड़. शरीर के अलावा खींचो जब तक midgut अवगत कराया है. Gut.The पेट से अतिरिक्त ऊतक निकालने संदंश का प्रयोग करें जैसे एक सफेद, शरीर थैली की तरह लग रहा है. 12 अच्छी तरह से एक गिलास और 0.2% mercurochrome 5-10 μl में स्लाइड विसर्जित कर अच्छी तरह से एक में gut.Mount पेट से अतिरिक्त ऊतक निकालें. स्क्वैश लोथ और 12-अच्छी तरह से स्लाइड जब तक अन्य मच्छरों के लिए नम कागज towel.Continue पर त्यागें भरा है. एक गिलास coverslip के साथ मुहिम शुरू की हिम्मत कवर.
- एक रोशनी खुर्दबीन के तहत हिम्मत जांच दौर oocysts / स्पष्ट बेहोश गुलाबी आंत ऊतक के खिलाफ उज्ज्वल गुलाबी दाग के लिए देख रहे हैं. Oocysts गणना, रिकॉर्ड और अगले नमूने के लिए जारी रखने के. सभी प्रयोगात्मक उपचार से मच्छरों की सभी के लिए आगे बढ़ें.
- जब समाप्त हो, एक कागज तौलिया के साथ साफ स्लाइड पोछ लो. हिम्मत के साथ कागज तौलिया और शवों के साथ कागज तौलिया प्लेस, छोटे biohazard बैग में और कचरे में त्यागें. दस्ताने प्रक्रिया के दौरान पहना रहे हैं. देखभाल के लिए किसी भी संक्रमित मच्छरों बच नहीं होने के लिए लिया जाता है.
Discussion
प्लाज्मोडियम संक्रमण और संक्रमण phenotype दृढ़ संकल्प में कुछ बदलाव हो सकता है और विभिन्न प्रयोगशालाओं विभिन्न तकनीकों का अनुसरण कर सकते हैं कर सकते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
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