Summary
שיטות רומן בעזרת מחשב של רכש בקנה מידה גדול וניתוח של immunohistochemically דגימות הלבלב מוכתם מתוארים: (1) ללכוד Slice וירטואלי של הסעיף כולו; (2) ניתוח המוניים בקנה מידה גדול של נתונים, (3) שחזור וירטואלי Slices 2D ; (4) מיפוי 3D איון; ו (5) ניתוח מתמטי.
Abstract
לבלב הוא איבר מיקרו ייחודית המורכבת מכמה הפרשת הורמון תאים אנדוקריניות כגון בטא תאים (אינסולין), אלפא תאים (גלוקגון), ואת דלתא תאים (somatostatin) המוטבעות הרקמות אקסוקרינית ו מהווים 1 - 2% של הלבלב כולו. קיים קשר הדוק בין משקל הגוף הלבלב. מסה סך בטא תא גם מגדילה באופן יחסי, כדי לפצות על הביקוש האינסולין בגוף. מה זה בורח הרחבה מידתית היא הפצה בגודל של איי. בעלי חיים גדולים כמו בני האדם חולקים גודל דומה איון הפצות עם עכברים, מה שמראה כי זה איבר מיקרו יש מגבלת גודל מסוים להיות פונקציונלי. חוסר היכולת של pancreata חיה גדולה ליצור איים יחסי גדול יותר מפוצה על ידי עלייה במספר איים ועל ידי עלייה בשיעור של איים גדולים יותר הכוללת תפוצתם גודל איון. יתר על כן, איים התערוכה פלסטיות בולט בהרכב ארכיטקטורה הסלולר בין מינים שונים גם בתוך אותו מין בתנאים pathophysiological שונים. במחקר הנוכחי, אנו מתארים גישות חדשות לניתוח של נתוני התמונה ביולוגיים על מנת להקל על אוטומציה של תהליכים אנליטיים, המאפשרים ניתוח של אוספי נתונים גדולים הטרוגנית בחקר תהליכים ביולוגיים כגון דינמי מבנים מורכבים. מחקרים כאלה כבר הקשו בשל קשיים טכניים של הדגימה משוחדת ויצירת בקנה מידה גדול ערכות נתונים בדיוק כדי לתפוס את המורכבות של התהליכים הביולוגיים של הביולוגיה איון. כאן אנו מציגים שיטות לאיסוף משוחדת "נציג" הנתונים בתוך הזמינות המוגבלת של דגימות (או למזער את אוסף לדוגמה) ואת ההגדרות ניסיוני סטנדרטי, כדי לנתח במדויק את המבנה המורכב תלת ממדי של איון. בסיוע מחשב מאפשר אוטומציה לאיסוף וניתוח של בקנה מידה גדול ערכות נתונים וגם מבטיח פרשנות מוטה של הנתונים. יתר על כן, כימות מדויק של התפלגות גודל איון ו קואורדינטות מרחביות (כלומר X, Y, Z-עמדות) לא רק מוביל הדמיה מדויקת של מבנה הלבלב איון הרכב, אלא גם מאפשר לנו לזהות דפוסים במהלך פיתוח והתאמה לתנאים שינוי באמצעות מודלים מתמטיים. השיטות שפותחו במחקר זה החלות על מחקרים של מערכות אחרות ואורגניזמים רבים.
Protocol
1. יצירת Slices וירטואלי של תמונות Immunohistochemically ויטראז
- פתח StereoInvestigator. מניחים את השקופית נקי מחזיק את המדגם בעל מיקרוסקופ ולדמיין אותו החוקר סטריאו ידי לחיצה על "רכישה" ולאחר מכן "תמונה חיה" (→ רכישת תמונה חיה). קביעת רמות החשיפה לכל ערוץ; בדוגמה ספציפית שלנו, ערוץ 2 משמש DAPI, ערוץ 3 של ה-GFP, ערוץ 4 של RFP, ערוץ 5 עבור Cy5, וערוץ 6 עבור Cy7. השתמש "היסטוגרמה וידאו" חלון, המציג את עוצמת הקרינה, על מנת לקבוע את רמת החשיפה. עוצמות הקרינה המתאימים הגיע כאשר עוצמת את זנבות בקצה הימני של ההיסטוגרמה וידאו. רמות חשיפה ניתן לשנות בחלון "הגדרות המצלמה". היסטוגרמה וידאו יכול להיות ממוקד עם גלגל פוקוס מיקרוסקופ.
- לפני יצירת Slice וירטואלי, מתאר את המדגם על ידי לחיצה על המסך בנקודה מן המדגם, אשר סימן נקודת התייחסות, ולאחר מכן לחיצה סביב קווי המתאר של המדגם. כאשר מתאר תושלם, קליק ימני ובחר "קונטור סגור" כדי לחבר את נקודות ההתחלה ואת הסוף.
- לאחר קונטור סגור, ללכוד Slice וירטואלי המדגם (רכישה → רוכשת Slice וירטואלי). כאשר החלון הוירטואלי Slice אפשרויות פתוח, בחר "מהירות גבוהה רוכשת", כמו גם התמקדות אוטומטית על ידי ביטול הסימון של התיבה לצד "ידני". שמור את הקובץ.
- פרוסה וירטואלית prefocus חייב להיות מכויל על ידי בחירה (קליק ימני → הוסף פוקוס רשימת אתרים) באופן ידני תוך התמקדות בסעיפים מספר אקראי, קרי, אתרים, בתצוגה המקדימה Slice וירטואלי. כאשר מספר אתרים כבר ממוקד, להתחיל את Slice וירטואלי (קליק ימני → התחל Slice וירטואלי עם Prefocus). לאחר Slice וירטואלי מדגם הראשונה תושלם, לעבור לערוץ הבא ולהתאים את החשיפה בהתאם. חזור על שלבים 4 ו - 5 עבור כל ערוץ.
2. בסיוע מחשב דו מימדי ניתוח
כימות איי
- התמונות מעובדים מכן באמצעות מאקרו ImageJ בשם "IHCVS," לראשונה מכינה תמונות טעון לניתוח ואז מכמת התכונות של איים כמו הרכב הסלולר (כלומר, כל האזור של A-ביתא, אלפא, ואת דלתא אוכלוסיות תאים, ו - איון אזור בשווי הסכום). מחסנית מחולק ערוצים נפרדים שלה ImageJ, כאשר כל ערוץ הפרט מראה תמונה נפרדת המבוססת על מכתים את immunohistochemical. תמונה כל כך thresholded באופן אוטומטי, לאחר מכן תמונה בשחור לבן של 8 סיביות, או מסכה, של התמונה thresholded מיוצר. התמונות ערוץ נפרד מתווספים אז יחד חשבונאית לתוך מסכה מרוכבים, ואת המובנה של ImageJ ניתוח החלקיקים מתבצע על התמונה מרוכבים.
- ROIs מזוהים אז בעוד למעט חלקיקים קטנים יותר מאשר תא אחד בודד בטא (<170 מיקרומטר 2; אזור מחושב באמצעות בקוטר של ~ 15 מיקרומטר; היצר et al, 2003).. ROIs כתוצאה מנותחים לכמת באמצעות ImageJ; כימות יכול לכלול המערכת (מרחק סביב שטח), המעגליות (מידה של עגלגלות שבו מספר 1.0 מתאר עיגול מושלם), בקוטר של Feret (המרחק הארוך ביותר באזור) מרכז קואורדינטות עבור כל אזור ניתח כך שהתפלגות איון ניתן לנתח באופן מתמטי באמצעות שילובים שונים של פרמטרים אלה להתוות גרף 3D, הנתונים אשר ישמשו מודלים מתמטיים. תמונה אחת פרוסה מנותח וירטואלי בתוך 30 שניות. מספר תמונות ניתן לנתח על ידי הטבעת עיבוד תמונה לתוך התסריט ניתוח תחביר לולאת נתמך על ידי שפת מאקרו ImageJ. לולאה פותח את כל הקבצים בספרייה מסוימת, מנתח את התמונות, תוצאות ותפוקות לתוך למיקום חדש כקובץ Excel.
- התוצאות נשמרות מצטברים לתוך גיליון אלקטרוני של Excel, אחסון נתונים, כגון השטח, ההיקף, המעגליות, בקוטר של Feret, מרכז איון איון עבור כל אחד, יחד עם המספרים המתאימים מסומן בתמונה.
ניתוח חישובית ההתקנה היסטוגרמה
- סקריפטים Mathematica, אשר להפעלה אוטומטית פעם נכתבו, משמשים לעבד את הנתונים שנאספו הגיליון, בהיקף של מאות אלפי רשומות. אחד התהליכים הקריטיים לרוץ הוא ניתוח תדר, אשר בונה היסטוגרמה המשמש לבדיקת התפלגות גודל וגם לקבוע חריגים בנתונים. על פי התסריט, אזור איון מוחלט נמדד לעומת פרמטרים אחרים, במיוחד בנקודות זמן או גיל של הלבלב ולאחר מכן מוצג בהתאם בגרף.
3. שחזור תלת ממדי של שתי תמונות ויטראז' Immunohistochemically מימדי Slice וירטואלי
שחזור 3D של Slices וירטואלי
- העתק את התסריט ("im_jp2_2_tiff") לתוך ספריית (כלומר, תיקייה) כימכיל את jp2 תמונות. להריץ את הסקריפט עם מעטפת לינוקס על ידי הקלדת "./im_jp2_2_tiff" לתוך המסוף ולאחר מכן הקשה על Enter. הרצת סקריפט זה יהיה להמיר באופן אוטומטי את כל jp2 התמונות במדריך לתוך קבצי tiff, שהוא הפורמט המשמש לבניית וכימות תלת ממדי ערימות של פרוסות וירטואלי. (הערה:. הקלד "chmod + x im_jp2_2_tiff" אם התסריט לא פועל, אשר יהיה להמיר את קובץ הטקסט לתוך סקריפט כך שהוא יכול לרוץ כמו שצריך)
- כאשר כל התמונות שנתפסו הומרו מ jp2 לקבצי TIFF, הם מוכנים לשמש עבור ניתוח ImageJ.
- עם ImageJ, לפתוח את כל התמונות למדגם הראשון (חמש תמונות במקרה זה: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) ולמזג אותן כתמונה אחת (תמונה → צבע → מיזוג ערוצים). חזור על תהליך זה עבור כל אחת מהדגימות. כאשר כל הדגימות היו משולבים כתמונות אחת, לנקות את התמונות על ידי בחירת אזורים לא רצויים עם כלי "בחירות מצולע" וממלאים אותם (→ ערוך מלא). (שינוי גודל התמונות לגודל קטן יותר, אם יש צורך). ואז להמיר כל תמונה לתמונה צבע RGB (תמונה → → סוג צבע RGB). לבסוף, ליצור ערימה מתוך התמונות (תמונה → ערימות ערימות → תמונה), לאחר מכן הם יכולים להמשיך להיות מתואם עם תוסף "רג סטאק", במידת הצורך. בסופו של דבר, מיזוג הערוצים ואז שילוב התמונות יוצר מונטאז' 3D של כל האיונים בלבלב כולו. כדי להציג את התמונה, לחץ על "תוספים" ולאחר מכן "הצופה 3D."
4. איילט מיפוי
איסוף מחסניות תמונה
- למקם הלבלב איים שלמים הר מתחת למיקרוסקופ.
- פתח את תוכנת Slidebook. גש "לכידת ומיקוד שליטה" על ידי לחיצה על "Ctrl + Shift + E." בחלון "בקרת פוקוס", להגדיר את המטרה כדי 20X או 40X, בהתאם לגודל של איון. החל מים אם באמצעות טבילה במים העדשה אובייקטיבי.
- על מנת להשתמש העינית מיקרוסקופ כדי לאתר איים, להגדיר "סל" עד 2X ולהגדיר את הגדר מסנן user1 בחלון "בקרת פוקוס". "בחירה פליטה" צריך להיות מוגדר עיניים 100% צפיפות ניטרלי 1. לחץ על "אי GFP" ולאחר מכן "פתח פלואוריד."
- כדי להמחיש את הדוגמה Slidebook, לחזור פוקוס שולטת החלון ולעבור "Set Filter" כדי "לחיות" ולחץ על "GFP DS". השתמש בג'ויסטיק כדי איון במרכז בחלון מצלמה 1 וכן אפשרי. פוקוס לעומק איפשהו ליד מרכז של איון, שבו תאים ניתן להבחין בקלות.
- ב "חלון בקרת פוקוס", בחר את הכרטיסייה "Z". לחץ על הגדר בפינה השמאלית העליונה של החלון כדי להגדיר את עומק הנוכחי כנקודת התייחסות. השתמש בשלט היקף כדי לגלול אל עומק העליון של איון שבו התכונות ניתן להבחין בבירור ולחץ על "הגדר למעלה." גלול לתחתית של איון ולחץ על "הגדר התחתונה". לחץ על "Go" כדי לחזור לנקודת ההתייחסות.
- בחלון לכידת, מערכת "פקטור סל" ל "2X" ולהגדיר "Set Filter" כדי "לחיות". בחר את "סוג לכידת" ל "3D" (ו 3D בלבד). בצד ימין של החלון, לחץ על "השתמש תפקידים, למעלה ולמטה." לחץ על "חזור אל נקודת ההתייחסות לאחר לכידת". בחר את "גודל שלב" ל "3".
- מתחת "הסט סינון", בחר DAPI dsu, GFP dsu, RFP dsu ו Cy5 Dsu. עבור כל אחד מהם, לחץ על "מצא את הטוב ביותר" תחת "כוונן חשיפה", ולאחר מכן לחץ על "בדיקה" כדי לוודא את החשיפה שנבחר מתאים. לחץ "התחל" כדי להתחיל את לכידתו.
- כאשר ללכוד הושלמה, להתאים את רמות לפי הצורך ולשנות את הצבע המוצג על RFP לבן. שמור את השקופית וללכת צפה → ייצוא → TIFF בסדרה. הקלד את השם של השקופית עם מקף בסוף ולשמור אותו. עשרות בודדות קובצי TIFF שנוצרו, כך שזה עשוי להיות מועיל כדי לשמור על הערימה כל תמונה של איון בתיקיה נפרדת.
מיפוי ערימות תמונה
- פתח החוקר סטריאו. דמיינו את התמונה על ידי פתיחת ערימות תמונה (Image File → סטאק → סטאק פתח תמונה). ב "תפריט שינוי גודל תמונה," לקבוע "המרחק בין תמונות" עד 3.00 מיקרומטר. כדי לתקן עבור binning 2X ב Slidebook, בחר "דרוס X ו-Y קנה מידה" ו "עבור המשתמש שצוין מקור של X ו-Y" קנה מידה, והזן 0.65 עבור שניהם X ו Y.
- מרכז את התמונה על ידי לחיצה באמצע איון של עניין "חלון מאקרו." סמן תא אחד לפחות באמצעות הסמן המתאים. Beta-תאים יופיעו ירוק, תאים אלפא יופיעו אדום, ותאי דלתא יופיעו לבן; מרקר שימוש 2 (עיגול חלול) כדי לסמן תאים בטא, דה מרקר 5 (משולש חלול) כדי לסמן תאים אלפא, דה מרקר 6 ( משולש חלול) לתאי דלתא. תאים צריך להיות מסומן במרכז הגרעין שלהם, אשר יופיעו כחול אם המדגם היה מוכתם DAPI.
- פעם אחת לפחות תא סומן, להציג את "הצג אורתוגונלית" באמצעות סמל בתפריט העליון. בדוק "Z-Filter" ו "סימטרי". טווח שלhould להיות מוגדר 15.00. החל ברמה Z 0.0, לגלול איון באמצעות גלגל העכבר ולסמן כל תא עם סמן המתאים. כל תא צריך להיות מסומן רק פעם אחת במרכז העומק שלה. עם סיום סימון לכל אחת רמות Z, "Z-מסנן" התיבה יכול להיות מסומנת. פעולה זו תציג את כל סמנים מכל Z-רמות.
- כאשר כל תא סומן, שמור את הקובץ בשם קובץ "DAT", ולאחר מכן ללכת קובץ → ייצוא האיתור. שמור את המעקב כקובץ "TXT". לחץ על "קובץ נתונים חדש" כדי לנקות את סביבת העבודה לפני שתנסה המפה איים חדשים.
5. נציג תוצאות:
הכנת פרוסות וירטואלי מתוך מדגם הלבלב מוכתם immunohistochemically מאפשרת לבחון כל התאים האנדוקרינית (אלפא, ביתא, דלתא ו-תאים) בלבלב כולו, שניהם יחד כמו איים (איור 1 א) ו בנפרד ערוצים נפרדים ( איור 1 ב). בסיוע תוכנות מחשב סקריפטים, ניתוח כמות גדולה של נתונים בקנה מידה גדול יכול להתבצע על אלה Slices וירטואלי. באופן ספציפי, ניתוח החלקיקים של מסכות מרוכבים (תרשים 1C) הוא פלט כמו טבלת הסטטיסטיקה המכיל פרמטרים כגון אזור איון, המערכת (המרחק סביב שטח), המעגליות (מידה של עגלגלות, שבה 1.0 מייצגת עיגול מושלם), ו קוטרו של Feret (המרחק הארוך ביותר בתוך שטח) עבור איון כל זוהה (1D איור). ניתוח בקנה מידה גדול של תוצאות אלו תמונות בייצור של מספר איון מוחלט והפצה היסטוגרמות גודל כמו גם השוואה מפורטת של אלפא, בטא, דלתא ו-cell אזורים. בנוסף, כל פרוסה וירטואלי נלקח בעומק של כ 5 מיקרומטר, וכל Slices הפרט הוירטואלי 2D נערמים נוסף כדי ליצור שחזור 3D של המדגם הלבלב כולו. מיפוי איילט מדגים לא רק מופע נוסף של לכידת איים ב-3D, אלא גם של ניתוח בעזרת מחשב מפורט. מיפוי איילט מורכב לכידתו של איים נפרדים (איור 2 א) ואת הבאים סימון של אלפא, בטא, דלתא ו-תאים שונים ב-Z מטוסים (תרשים 2B) כדי להמחיש איון ב-3D (איור 2 ג, ד). ניתוח מתמטי אוטומטי של איים ממופה מציג הרכב הסלולרי שלהם ואדריכלות, כולל תאים תאים מרחקים (2E איור) ואת ההסתברות המצטברת של תאים תאים הפצות מרחק (תרשים 2F).
באיור 1. בקנה מידה גדול ללכוד וניתוח של הפצה באמצעות איון Slice וירטואלי. א Virtual להציג פרוסת קטע לבלב אנושיים. א מכתים immunohistochemical עבור אינסולין (ירוק), גלוקגון (אדום), somatostatin (לבן) ו DAPI (כחול). ב המרה 8-bit מסכה לאחר thresholding אוטומטי. אזור התאגרף מוגדל ב צפיות BB של כל ערוץ. א דלתא תאים, ב בטא תאים, כ אלפא תאים, ד התמזגה תמונה מורכבת. ניתוח ג החלקיקים ביצע על מסכת מרוכבים. שים לב שכל מבנה איון כולל אשכולות תאים קטנים ממוספר (סמן כחול). ד סטטיסטיקה טבלת פרמטרים שונים נמדד מבנים בודדים, אשר יש המזהים המתאימים תגי מוצג ג
איור 2. ניתוח Slice וירטואלי immunohistochemical. א 3D העלילה פיזור של איור 1 מראה בגודל ובצורה והפצה של איון כל לפי פרמטרים כגון שטח, מעגליים בקוטר של feret. העלילה ב 3D פיזור של איור 1 מראה הרכב איון גודל הסלולר. ג הפצה איילט גודל של ניתוח קטע שלם האדם מן איור 1 מצויד הפצה הסתברות lognormal צפיפות. ד ניתוח מתמטי של יחסי הרכב הסלולר (בטא תאים ירוקים, אלפא תאים אדומים דלתא תאים כחול) עבור סל בקוטר איון כל יעיל של איור 1. א א איילט התפלגות גודל של ניתוח דגימה אקראית immunohistochemical (משמאל). איילט התפלגות גודל של ניתוח פרוסה וירטואלית (מימין). ב התחבר נורמלי העלילה השוואה של ניתוח דגימה אקראית immunohistochemical (אדום) פרוסה וירטואלית (כחול).
3. איור איילט מיפוי וניתוח מתמטי של הרכב ארכיטקטורה הסלולר. ת: לכידת מסך המציגה מטוס מוקד אחד מתוך ערימה של תמונות 3D המשוחזר של איון אדם נטען לתוך החוקר-Stereo (בטא תאים ירוקים, אלפא תאים אדומים, דלתא תאים לבנים, גרעינים בכחול) . ב ': תמונות פלואורסצנטי (משמאל) הנתונים הממופים המקביל (מימין) בשלושה מישורים מוקד שונים הראו בהפרש של 10 מיקרומטר. C: נוף נציג 3D נתוני מיפוי מחדש איון. D: שחזור 3D של איון רבע פרוס על בסיס הקואורדינטות מתקבל על ידי מיפוי איון. E: ניתוח מתמטי של הרכב ארכיטקטורה הסלולר. Left. שכיחות יחסית של תאים תאים המרחקים בין שני תאים באוכלוסייה תא בודד. העכבר. שכיחות יחסית של תאים תאים המרחקים בין שתי אוכלוסיות תאים שונות. פריץ: קולמוגורוב-סמירנוב (KS) מבחן. השמאל. הסתברויות מצטברות של התא אל התא מרחק הפצות עבור אלפא ל-אלפא, בטא ל-ביתא, ו דלתא ל-delta תאים. העכבר. KS מרחקים במשך שלוש הסתברויות המקביל מצטבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסיוע מחשב בקנה מידה גדול להדמיה וכימות המוצגים כאן להרשות ארבע נקודות מפתח במחקרים לבלב: (1) ניתוח בקנה מידה גדול של דגימות הלבלב מספק תצוגה מקיפה של הפצה הגודל הכולל איון ואדריכלות איון. (2) שחזור 3D ו ניתוח מתמטי של הרכב ארכיטקטורה הסלולר נוספת להקל על בחינה של הסדר המרחבי של תאים אנדוקריני תוך איון. (3) פלסטיות איון הכאת בין מינים שונים של אותו מין בתנאים pathophysiological שונים עשויים להציע הסתגלות אבולוציונית רכשה בתגובה לשינויים מטבוליים, ולא הבדלים מינים. (4) סידור מחדש של הרכב האנדוקרינית הסלולר ואדריכלות איון, יחד עם שינויים בביטוי גנים מסוימים, עשויים לשקף הסתגלות איון במאפייני הפונקציונלי, אשר נוסף מצביע על חשיבות תפקידו של הרשת האנדוקרינית intraislet התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי ארצות הברית השירות לבריאות הציבור של גרנט DK-081527, 072473 ו DK-DK-20595 של אוניברסיטת שיקגו סוכרת מחקר מרכז הדרכה (Core מודלים בבעלי חיים), ואת מתנת קרן משפחת קובלר.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | IX-81 | |
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus |
References
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition. ISLETS. 2, 135-145 (2010).
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. Islet architecture - a comparative study. ISLETS. 1, 129-136 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
