Summary
Immünohistokimyasal lekeli pankreas örneklerin büyük ölçekli satın alma ve analiz Roman bilgisayar destekli yöntemler açıklanmıştır: (1) Sanal Dilim yakalama bölümün tamamını, büyük ölçekli veri (2) Kütle analiz 2D Sanal Dilimleri (3) İmar (4) 3D adacık haritalama ve (5) matematiksel analizi.
Abstract
Pankreas adacık beta-hücrelerinin (insülin), alfa-hücrelerinin (glukagon) ve delta-ekzokrin dokularda gömülü ve 1 oluşturan hücreleri (somatostatin) gibi birçok hormon salgılayan endokrin hücrelerde oluşan benzersiz bir mikro-organ- tüm pankreas% 2. Vücut ve pankreas ağırlığı arasında yakın bir korelasyon vardır. Toplam beta hücre kitlesinin de vücutta insülin talebi telafi etmek için orantılı olarak artar. Bu orantılı genişleme adacık boyutu dağılımı kaçar. Büyük hayvanların insanlar gibi, bu mikro-organ işlevsel olması için belirli bir boyut sınırı olduğunu düşündüren, fare ile benzer bir adacık boyutu dağılımları paylaşıyoruz. Orantılı olarak daha büyük adacıklar oluşturmak için büyük hayvan pancreata yetersizlik adacık sayısında bir artış ve genel adacık boyutu dağılımı büyük adacıklar oranında bir artış ile telafi edilmektedir. Ayrıca, adacık hücre yapısı ve mimarisi, farklı türler arasında ve aynı zamanda çeşitli patofizyolojik koşullar altında aynı türün içinde çarpıcı bir plastisite sergilerler. Bu çalışmada, geniş ve heterojen veri toplama ve analiz için dinamik biyolojik süreçlerin ve karmaşık yapılara sahip çalışmaya izin analitik süreçlerin otomasyonu kolaylaştırmak için biyolojik görüntü verilerini analiz için yeni yaklaşımlar açıklanmaktadır. Böyle çalışmalar tarafsız örnekleme teknik zorluklar nedeniyle engellendiği ve büyük ölçekli veri üreten adacık biyoloji biyolojik süreçlerinin karmaşıklığı tam olarak yakalamak için ayarlar var. Burada örneklerin sınırlı sayıda (ya da örnek toplama en aza indirmek için) ve standart deneysel ayarları içinde tarafsız "temsili" verileri toplamak ve adacık karmaşık üç boyutlu yapısını tam olarak analiz etmek için yöntemler göstermektedir. Bilgisayar destekli otomasyon, büyük ölçekli veri setleri toplama ve analiz sağlar ve aynı zamanda verilerin tarafsız bir yorumlama sağlar. Ayrıca, adacık boyutu dağılımı ve mekansal koordinatları (yani X, Y, Z-pozisyonlar) kesin kantifikasyon sadece pankreas adacık yapısı ve bileşimi doğru bir görselleştirme için değil, aynı zamanda bize, geliştirme ve adaptasyon sırasında desen değiştiren koşulları tanımlamanıza olanak sağlar matematiksel modelleme yoluyla. Bu çalışmada geliştirilen yöntemlerin yanı sıra birçok diğer sistemlerin ve organizmaların çalışmaları için geçerli.
Protocol
1. İmmünohistokimyasal Vitray Resimler Sanal Dilimleri oluşturma
- Açık StereoInvestigator. Örnek mikroskop sahibinin tutan temiz bir slayt yerleştirin ve "Canlı Image" sonra "Acquisition" (Toplama → Canlı Görüntü) tıklayarak ve Stereo Araştırmacı görselleştirmek. Her kanal için maruz kalma seviyeleri belirlemek; bizim belirli bir örnek, Kanal 2 Cy7 DAPI, Kanal 3 Cy5 için GFP, RFP, Kanal 5 Kanal 4 ve Kanal 6 için kullanılır. Maruz kalma düzeyini belirlemek için, floresan yoğunluğu görüntüler "Video Histogram" penceresini kullanın. Uygun floresan yoğunlukları ulaşıldığında Video Histogram sağ ucunda yoğunluğu kuyrukları kapalı. Maruz kalma seviyeleri "Kamera Ayarları" penceresinde değiştirilebilir. Video Histogram mikroskop odak tekerleği ile odaklı olabilir.
- Sanal Dilim oluşturmadan önce, ekranda bir referans noktası örnek uzak bir noktaya tıklayarak ve daha sonra örnek dışhatlarını tıklayarak örnek kontur. Kontur tamamlandığında, sağ tıklayın ve başlangıç ve bitiş noktalarını bağlamak için "Kapat Kontur" seçin.
- Kontur kapalı sonra, örnek Sanal Dilim (Kazanç → Sanal Dilim Edinme) yakalamak. Sanal Dilim pencere seçenekleri seçin, "Yüksek Hız Edinme" yanı sıra yanındaki kutunun işaretini kaldırarak otomatik odaklama "Kılavuzu." Dosyayı kaydedin.
- Yani, siteleri sanal dilim prefocus Sanal Dilim önizleme, seçerek kalibre (sağ tıklayıp → Site Listesi Odak ekle) ve birkaç rastgele bölümleri elle odaklama gerekir. Birkaç siteleri odaklı olduğunda, Sanal Dilim başlatmak (sağ tıklayın → Prefocus ile Sanal Dilim Başlat). Ilk örnek Sanal Dilim tamamlandıktan sonra, bir sonraki kanala geçiş ve pozlamayı buna göre ayarlamak. Her kanal için 4. ve 5. adımları tekrarlayın.
2. Bilgisayar destekli İki Boyutlu Analizi
Islets, ölçümü
- Bu görüntüler daha sonra (yani beta-alfa-ve delta-hücre popülasyonları her alanda adacık hücre kompozisyon gibi özellikleri analiz için yüklenen görüntüler hazırlar ve daha sonra rakamlarla "IHCVS" adında bir ImageJ makro kullanarak işlenmiş ve adacık. alan) toplam değer. Yığını, her bir kanal immünohistokimyasal dayalı ayrı bir görüntü gösterir, ImageJ ayrı kanal ayrılmıştır. Her görüntü eşiklenir görüntü 8-bit, siyah ve beyaz bir görüntü, ya da bir maske, daha sonra otomatik olarak üretilen bu tarihten sonra eşiklenir. Kompozit bir maske içine ayrı bir kanal görüntüler daha sonra aritmetik birlikte eklenir ve kompozit görüntü ImageJ dahili partikül analizi yapılır.
- Tek bir beta hücre daha küçük parçacıklar hariç ROI'ler sonra tanımlanır (<170 mikron 2 Hara ve ark, 2003; ~ 15 mm çapında kullanılarak hesaplanmıştır). Ortaya çıkan ROI'ler analiz ve ImageJ kullanarak sayısal kantifikasyon çevre (bir alanı çevreleyen bir mesafe), dairesellik (sayı, 1.0 mükemmel bir daire gösteriyor yuvarlaklık derecesi), Feret çapı (bir alanda en uzun mesafe) ve merkezi analiz her bölge için koordinatları, böylece bu parametrelerin çeşitli kombinasyonları kullanarak adacık dağılımının matematiksel analiz ve 3D grafik çizilen olabilir, veri hangi matematiksel modelleme için kullanılan olacak. Tek bir sanal dilim resim, 30 saniye içinde analiz edilir. Birden fazla resim, görüntü işleme ve analiz komut dosyası ImageJ makro dili ile desteklenen bir döngü sözdizimi içine gömerek analiz edilebilir. Döngüsü, belirli bir dizindeki tüm dosyaları açar görüntülerini analiz eder, ve bir Excel dosyası olarak yeni bir konuma sonuçları verir.
- Toplu sonuçları görüntü etiketli karşılık gelen numaraları ile birlikte, alan, çevre, dairesellik, Feret çapı ve her adacık adacık merkezi gibi veri depolama, bir Excel elektronik tabloya kaydedilir.
İşlemsel Analiz ve Histogram Kurulum
- Otomatik olarak bir kez başlatan çalıştırmak Mathematica scriptleri, yüz binlerce girdileri tutarında, toplanan elektronik tablo verilerini işlemek için kullanılır. Çalıştırılır kritik süreçlerin biri bir frekans analizi, boyut dağılımı incelemek ve aynı zamanda veri aykırı belirlemek için kullanılan bir histogram oluşturur. Komut dosyası altında, toplam adacık alan ölçülür ve diğer parametrelere göre, özellikle zaman puan veya pankreas yaş ve buna uygun bir grafik görüntülenir.
3. İki Boyutlu İmmünohistokimyasal Vitray Sanal Dilim Resimleri Üç Boyutlu Rekonstrüksiyon
3D Sanal Dilimleri İmar
- Komut dosyası ("im_jp2_2_tiff") (yani, klasör) dizin içine kopyalayınJP2 görüntüleri içerir. Linux kabuk komut dosyası konsol içine "./im_jp2_2_tiff" yazarak ve sonra enter'a basarak çalıştırın. Bu betik çalıştırma Sanal Dilimleri üç boyutlu yığınlarının inşaat ve ölçülmesi kullanılan biçimidir tiff resimler, otomatik olarak tüm dizinde JP2 görüntüleri dönüştürmek olacak. (Not: Türü "chmod + x im_jp2_2_tiff" düzgün bir şekilde çalıştırmak, böylece bir komut dosyası içine metin dosyasına dönüştürmek komut dosyasını çalıştırın değilse,)
- Çekilen görüntülerin tüm JP2 tiff dosyalarını dönüştürülmüş zaman, onlar ImageJ analiz için kullanılmak üzere hazır.
- ImageJ ile tüm görüntüleri, ilk örnek (Bu durumda beş görüntüler: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) açın ve bir resim (Image → Renkli → Birleştirme Kanallar) olarak bunları birleştirmek. Numunelerin her biri için bu işlemi tekrarlayın. Tüm örneklerin tek bir görüntü olarak kombine edildiğinde, "Poligon Seçimleri" aracı ile istenmeyen bölgelerin seçilmesi ve (Edit → doldurun) onları doldurma görüntüleri temizleyin. (Gerekirse, daha küçük bir boyuta yeniden boyutlandırma). Sonra bir RGB renk görüntü (Resim → Tip → RGB renk) her bir görüntü dönüştürün. Son olarak, gerekirse, daha da "Yığın Reg" eklentisi ile uyumlu hale getirilmesi bu tarihten sonra, (Yığınları Görüntü → Yığınları → Görüntü) bir yığın görüntü oluşturmak. Sonuçta, tüm pankreas adacık tüm 3D montaj kanalları birleştirilmesi ve daha sonra görüntüleri birleştirerek oluşturur. Görüntülemek için "3B görüntüleyici." Daha sonra "Eklentiler" tıklayın ve
4. Islet Haritalama
Görüntü Yığınları Toplama
- Mikroskop altında tüm montaj pankreas adacık bulunurdu.
- Slidebook yazılımını açın. "Ctrl + Shift + E" tuşuna basarak "Yakalama ve Kontrol Focus" Erişim "Odaklama Denetimi" penceresinde, adacık boyutuna göre, 20X veya 40X, hedef olarak belirlemiştir. Bir suya daldırma objektif lens kullanıyorsanız su uygulayın.
- "Bin", "Focus Denetimleri" penceresi 2X ve Kullanıcı1 Filtre Set set, adacıklar bulmak için mikroskop mercek kullanmak için. "Emisyon Seçimi",% 100 Eyes ve 1 Nötr Yoğunluk olarak ayarlanması gerekir. Sonra "GFP ey" ni ve "Açık Fluor."
- Slidebook örnek görselleştirmek için, Focus, pencere Kontrolleri ve "Live" tıklayın ve "Filtre Set" anahtarı "GFP ds." Kamera 1 pencerede adacık merkezi yanı sıra olası joystick'i kullanın. Derinliğe kadar adacık hücreleri kolayca ayırt edilebilir merkezine yakın bir yere odaklanın.
- "Odak Kontroller Pencere", "Z sekmesinde" i seçin.. Bir referans noktası olarak mevcut derinliği ayarlamak için pencerenin sol üst köşesinde tıklayın. Adacık özellikleri açıkça ayırt edilebilecek en üst derinliği gidin ve kapsamı denetimi kullanın "En iyi ayarlayın." Adacık altına gidin ve "Set Alt." Referans noktası geri dönmek için "git" tıklayın.
- Yakalama penceresi, "2X" "Bin Faktörü" ve "Filtre Seti" "Canlı." "Yakala Türü", "3D" (ve sadece 3D) ayarlayın. Pencerenin sağ tarafında, "Üst ve Alt Pozisyonlar kullanın" seçeneğine tıklayın.. "Yakalama Noktası Sonrası Referans dön." "Adım Boyutu" Set "3"
- Altında "Filtre Box Set" seçeneğini seçin DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU ve Cy5 DSU Her biri için, "Pozlama ayarlayın," sonra "Test" Seçilen pozlama uygun olduğundan emin olmak için tıklayın altında "En İyi Bul" tıklayın. Yakalama başlamak için "Başlat" düğmesini tıklayın.
- Yakalama işlemi tamamlandığında, gerektiği gibi seviyelerini ayarlamak ve beyaz RFP için görüntülenen renk değiştirmek. Slayt kaydetme ve → İhracat → TIFF serisi gidin. Sonunda bir çizgi ile slayt adını yazın ve kaydedin. Düzinelerce bireysel TIFF dosyası oluşturulur, her adacık görüntü yığını ayrı bir klasörde tutmak için yararlı olabilir.
Görüntü Yığınları eşleme
- Stereo Araştırmacı açın. Görüntü yığınları (Dosya → Görüntü Yığın → Görüntü Yığın Aç) açarak görüntü gözünüzde canlandırın. "Görüntü Ölçeklendirme menüsü 3.00 mikron," set "Görüntüler Arası Mesafe". Slidebook 2X binning düzeltmek için, "Baskın X ve Y Ölçekleme" ve Ölçek "X ve Y Kaynak Belirtilmemiş Kullanıcı" seçeneğini seçin ve X ve Y. hem 0.65 girin
- Ilgi adacık ortasında tıklayarak Merkezi görüntü "Makro penceresi." Uygun bir kalem kullanarak en az bir hücre işaretleyin. Beta-hücrelerinde yeşil görünür, alfa hücreleri kırmızı görünecektir ve delta hücreleri, beyaz görünecektir; kullanım Marker 2 (içi boş daire), alfa hücreleri işaretlemek için beta hücreleri, Marker 5 (içi boş bir üçgen) işaretlemek için, Marker 6 ( delta hücreleri içi boş bir üçgen). Hücreler örnek DAPI ile boyanmış olup olmadığını mavi görünecektir çekirdeği, merkezi işaretlenmiş olmalıdır.
- En az bir hücre işaretlenmiş edildikten sonra, üst menüdeki simgesini kullanarak "Ortogonal Görünüm" gösterilecek. "Z-Filter" ve "Simetrik." Aralığıhould 15,00 ayarlanması gerekir. 0.0 Z düzeyinde başlayarak, fare tekerleğini kullanarak adacık ilerlemek ve uygun marker ile her hücre işareti. Her hücre derinliği merkezinde sadece bir kez işaretlenmiş olmalıdır. Z-seviyesi her işaretleme, "Z-filtre" onay kutusunu işaretlenmemiş olabilir bittikten sonra. Bu Z seviyeleri tüm belirteçlerin gösterecektir.
- Her hücrede işaretlenmiş edildiğinde, "DAT" dosyası olarak kaydedin, sonra Dosya → İhracat İzleme gidin. Izleme "TXT" dosya olarak kaydedin. "Yeni Veri Dosyası" yeni adacıklar haritaya denemeden önce çalışma alanını temizlemek için tıklayın.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Sanal Dilimleri immünohistokimyasal lekeli bir pankreas örnek hazırlanması (her ikisi birlikte adacıklar (Şekil 1A) ve ayrı ayrı ayrı kanallarda, bütün pankreas (alfa, beta ve delta hücreleri) endokrin hücrelerinin tümünü incelemek için bir olanak sağlar Şekil 1B). Büyük ölçekli veri bir kitle analizi, bilgisayar programları ve scriptler yardımı ile bu sanal Dilimleri yapılabilir. Özellikle, kompozit maskeleri (Şekil 1C) bir parçacık analizi, adacık alanı, çevre (bir alanı çevreleyen mesafe), dairesellik (yuvarlaklık derecesi, 1.0 mükemmel bir daire temsil eder) gibi parametreleri içeren bir istatistik tablosu olarak çıktı ve her adacık Feret çapı (bir alanda en uzun mesafe) (Şekil 1D) tespit edildi. Büyük ölçekli üretiminde toplam adacık sayısı ve büyüklüğü dağılımı histogramlar alfa-beta ve delta-hücre alanlarda ayrıntılı bir karşılaştırma yanı sıra bu görüntüleri sonuçlarının analizi. Buna ek olarak, her bir Sanal Dilim yaklaşık 5 mm derinlikte alınır ve tüm bireysel 2D Sanal Dilimler daha tüm pankreas örnek bir 3D yeniden oluşturmak için yığılmış. Islet haritalama 3D adacıklar yakalama değil, sadece başka bir örneğini gösterir, ancak aynı zamanda bilgisayar destekli detaylı analiz. Islet haritalama ayrı adacıklar yakalama (Şekil 2A) ve markalama sonraki oluşur alfa-beta ve delta-hücreleri çeşitli Z-uçakları (Şekil 2B) 3D bir adacık (Şekil 2C, D) görselleştirmek için. Otomatik matematiksel analiz eşlenen adacık hücre-hücre mesafeleri (Şekil 2E) ve hücre-hücre mesafe dağılımları (Şekil 2F) kümülatif olasılıkları da dahil olmak üzere kendi hücresel yapısı ve mimari, görüntüler.
Şekil 1. Sanal Dilim kullanarak adacık dağıtım Büyük ölçekli yakalama ve analizi. A. Sanal dilim bir insan pankreas bölümünde görüntüleyebilirsiniz. a. Immünohistokimyasal boyama (yeşil) insülin, glukagon (kırmızı), somatostatin (beyaz) ve DAPI (mavi). b. Otomatik eşikleme sonra 8-bit maskesi dönüştürülür. Kutulu alan her kanal BB Views büyütülmüş. a. delta-hücreleri, b. beta-hücrelerinin, c. alfa-hücreleri ve d. kompozit görüntü birleşti. C. Partikül analizi kompozit maske üzerine yapıldı. Küçük hücre kümeleri dahil olmak üzere her adacık yapısı (mavi vurgulamak) numaralı olduğunu unutmayın. C'de gösterildiği etiketleri karşılık kimlikleri, bireysel yapılar için ölçülen çeşitli parametreler D. İstatistikler tablo,
Şekil 2 immünohistokimyasal Sanal Dilim analizi. Şekil 1 A. 3D dağılım arsa alanı, dairesellik ve feret çapı gibi parametrelerin büyüklüğü ve şekli her adacık dağılımını gösteren. Şekil 1 B. 3D scatter plot hücresel adacık kompozisyon ve boyutunu gösterir. Lognormal olasılık yoğunluk dağılımı Şekil 1 C. tüm insanlık bölüm analizi Islet boyutu dağılımı takılmıştır. D. hücresel bileşim oranlarının matematiksel analizi (beta-hücrelerinin yeşil, mavi, kırmızı ve delta-hücreleri alfa-hücreleri) Şekil 1'de her adacık etkili çapı bin. E. a. Rastgele örnekleme immünohistokimyasal analiz Islet boyutu dağılımı (solda). Sanal dilim analiz Islet boyutu dağılımı (sağda). b. Rastgele örnekleme immünohistokimyasal analizi (kırmızı) ve sanal dilim (mavi) log-normal arsa karşılaştırılması.
Şekil 3 Islet haritalama ve hücresel yapısı ve mimari matematiksel analizi. A: Ekran yakalama 3D Stereo Araştırmacı içine yüklenen bir insan adacık görüntüleri yeniden inşa yığını (kırmızı, yeşil, alfa-hücreleri beta-hücrelerinin, delta-beyaz hücreleri ve mavi çekirdekleri) tek bir odak düzlemli . B: Floresan görüntü (solda) ve üç farklı odak düzlemleri ilgili eşlenen verileri (sağda), 10 mikron aralıklarla gösterilmiştir. C: 3D yeniden inşa adacık harita verileri Temsilcisi. D: 3 boyutlu rekonstrüksiyon adacık haritalama ile elde edilen koordinatlara göre çeyrek dilimlenmiş adacık. E: hücresel yapısı ve mimari matematiksel analizi. Left. Göreli frekans tek bir hücre popülasyonu iki hücre arasındaki hücre-hücre mesafelerin. Sağ. Hücre-hücre iki farklı hücre popülasyonlarının arasındaki mesafelerin Göreli frekans. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) testi. Sol. Kümülatif olasılıkları hücre-hücre-alfa alfa-uzaktan dağılımları, beta-beta ve delta-delta hücreleri. Sağ. KS ilgili üç kümülatif olasılıkları mesafeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Büyük ölçekli bilgisayar destekli görselleştirme ve miktar burada pankreas adacık çalışmalarında dört temel nokta göze sundu: (1) büyük ölçekli pankreas örneklerin analizi, genel adacık boyut dağılımı ve adacık mimarisi kapsamlı bir bakış sağlar. (2) hücresel bileşimi ve mimarinin 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve matematiksel analiz, bir adacık içerisinde endokrin hücreler mekansal düzenleme inceleme daha kolaylaştırır. (3) ve çeşitli patofizyolojik koşullar altında aynı türün farklı türler arasında çarpıcı bir adacık plastisite Kobayın ziyade, metabolik değişikliklere yanıt olarak evrimsel olarak edinilmiş adaptasyon önerebilir. (4), belirli gen ekspresyonu değişiklikleri ile birlikte endokrin hücre kompozisyon ve adacık mimarisi, yeniden düzenlenmesi, adacık adaptasyon, intraislet endokrin hücre ağının rolünün önemini ortaya koymaktadır fonksiyonel özellikleri yansıtıyor olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Çalışma tarafından desteklenen ABD Kamu Sağlığı Servisi Hibe DK-081.527, DK-072.473, Chicago Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi (Hayvan modeller Core) Üniversitesi ve Kovler Aile Vakfı hediye DK-20.595.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | IX-81 | |
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus |
References
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition. ISLETS. 2, 135-145 (2010).
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. Islet architecture - a comparative study. ISLETS. 1, 129-136 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
