Summary
immunohistochemically 스테인드 췌장 표본의 대규모 조달 및 분석의 새로운 컴퓨터를 이용한 방법에 설명되어 있습니다 : 전체 섹션 (1) 가상 슬라이스 캡처를, 대규모 데이터 (2) 질량 분석, 2D 가상 조각 (3) 재건 (4) 3D 아일릿 매핑, 그리고 (5) 수학 분석.
Abstract
췌장 아일릿는 베타 세포 (인슐린), 알파 세포 (글루카곤) 및 exocrine 조직에 포함된 1을 구성하는 델타 - 전지 (somatostatin)와 같은 여러 호르몬 secreting의 내분비 세포로 구성된 독특한 마이크로 기관입니다 - 전체 췌장의 2 %. 신체 및 췌장의 무게 사이에 밀접한 상관 관계가있다. 총 베타 세포 질량은 또한 몸 속에 인슐린의 수요에 대한 보상에 비례하여 증가합니다. 무엇이 비례 확장 아일 레츠의 크기 분포는 탈출. 같은 인간 같은 큰 동물이 마이크로 기관은 기능이 될 수있는 특정 크기 제한을 갖고 제안, 마우스와 유사한 아일릿 크기 배포판을 서로 나누세요. 비례 큰 아일 레츠를 생성하기 위해 대형 동물 pancreata의 무능력은 아일 레츠의 수가 증가하고 전체 아일릿 크기 분포에 큰 아일 레츠의 비율의 증가에 의해 보상됩니다. 또한, 아일 레츠 다양한 pathophysiological 조건 하에서 같은 종 내에서 서로 다른 종 사이 세포 조성과 건축과 또한 인상적인 소성을 나타냅니다. 현재 연구에서 우리는 이러한 역동적인 생물 학적 프로세스와 복잡한 구조의 연구에 대규모 이기종 데이터 컬렉션의 분석을 위해 수 있도록 분석 프로세스의 자동화를 촉진하기 위해 생물 학적 이미지 데이터의 분석을위한 새로운 접근 방법을 설명합니다. 이러한 연구로 인해 불편 샘플링의 기술적 어려움을 방해하고 대규모 데이터를 생성하는 것은 정확하게 아일릿 생물학의 생물 학적 프로세스의 복잡도를 캡처 설정되었습니다. 여기 샘플의 제한된 가용성 (또는 샘플 수집을 최소화하기 위해) 및 표준 실험 설정 이내 편견 "대표"데이터를 수집하고, 아일릿의 복잡한 입체 구조를 정확하게 분석하는 방법을 보여줍니다. 컴퓨터를 이용한 자동화 대규모 데이터 세트의 수집 및 분석을위한 수 있으며, 데이터의 편견 해석을 보장합니다. 또한, 아일릿 크기 분포와 공간 좌표 (즉, X, Y, Z - 위치)의 정확한 양을 정함뿐만 아니라 췌장 아일릿 구조 및 조성의 정확한 시각화로 연결뿐만 아니라, 우리가 변경 조건을 개발하고 적응하는 동안 패턴을 파악할 수 있습니다 수학적 모델링을 통해. 본 연구에서 개발된 방법은뿐만 아니라 다른 많은 시스템과 생물의 연구에 적용됩니다.
Protocol
1. Immunohistochemically 스테인드 이미지의 가상 조각 만들기
- 오픈 StereoInvestigator. 현미경 홀더에 샘플을 들고 청소 슬라이드를 삽입하고 "라이브 이미지"(수집 → 라이브 이미지) 후 "취득"을 클릭하고하여 스테레오 인베스티게이터에 그것을 시각화. 각 채널에 대한 노출 수준을 결정, 우리의 구체적인 예제에서, 채널 2 Cy7에 대한 DAPI, Cy5에 대한 GFP, RFP, 채널 5 채널 4 채널 3, 채널 6에 사용됩니다. 노출 수준을 결정하기 위해, 형광의 강도를 표시하는 "비디오 히스토그램"창을 사용합니다. 적절한 형광 농도에 도달하는 경우 비디오 히스토그램의 오른쪽 끝에있는 강도 꼬리 내려. 노출 수준은 "카메라 설정"창에서 변경할 수 있습니다. 비디오 히스토그램은 현미경의 초점 바퀴로 초점을 맞추고 있습니다.
- 가상 슬라이스를 만들기 전에, 기준점을 표시합니다 떨어진 샘플에서 지점에서 화면을 클릭하고, 다음 예제의 개요 주변을 클릭하여 샘플을 컨투어. 등고선이 완료되면 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 시작 및 끝 지점을 연결하는 "닫기 컨투어"를 선택하십시오.
- 등고선이 닫힌 후, 예제에 대한 가상 슬라이스 (취득 → 가상 슬라이스를 취득)을 캡처합니다. 열린 가상 슬라이스 창 옵션 "고속은 취득"뿐만 아니라 자동으로 옆에있는 확인란의 선택을 취소하여 초점을 선택하면 "수동." 파일을 저장합니다.
- 가상 슬라이스 prefocus은 즉, 사이트는 가상 슬라이스 미리보기, 선택에 의해 보정 (오른쪽 클릭 → 사이트 목록을 포커스에 추가)와 수동으로 여러 임의의 부분을 집중해야합니다. 여러 사이트가 집중되었을 경우, 가상 슬라이스 시작 (마우스 오른쪽을 클릭 → Prefocus와 가상 슬라이스를 시작합니다.) 첫 번째 예제의 가상 슬라이스가 완료되면 다음 채널로 전환하고 이에 따라 노출을 조정합니다. 각 채널에 대해 4 단계와 5 단계를 반복합니다.
2. 컴퓨터를 이용한 2 차원 분석
아일 레츠의 부량
- 이미지는 다음 첫 번째 (즉, 베타, 알파, 델타 세포 인구의 각 영역과 같은 세포 구성 등 아일 레츠의 특징을 분석 로드된 이미지를 준비하고 단정 "IHCVS"라는 ImageJ 매크로를 사용하여 처리하고, 아일릿 아르 합계 값 구역). 스택은 각 채널 immunohistochemical 얼룩에 따라 별도의 이미지를 보여주는 여기서 ImageJ 년 별도 채널로 나뉩니다. 각각의 이미지가 자동으로 thresholded 이미지의 8 비트 흑백 이미지 또는 마스크, 생산되는 후, thresholded입니다. 별도의 채널 이미지는 다음 복합 마스크로 arithmetically 함께 추가하고, ImageJ에 내장된 입자 분석 합성 이미지에 수행됩니다.
- 하나의 베타 세포보다 작은 입자를 제외 동안 로아는 다음 구분됩니다 (<170 μm의 2,하라 외, 2003.; 지역 ~ 15 μm의의 직경을 사용하여 계산). 결과 로아 분석 및 ImageJ를 사용하여 계량되며 부량는 경계 (주변 거리), 순환성 (숫자 1.0는 완벽한 원을 모습 진원도의 정도), Feret의 직경 (지역 가장 긴 거리)와 센터를 포함할 수 있습니다 각각의 분석 영역에 대한 좌표 있도록 아일릿 분포가 수학적으로 이러한 매개 변수의 다양한 조합을 사용하여 분석하고 3 차원 그래프로 꾸몄다 수있는 데이터가있는 수학적 모델링을 위해 사용됩니다. 단일 가상 슬라이스 이미지는 30 초 이내에 분석이다. 여러 이미지가 ImageJ 매크로 언어가 지원하는 루프 구문에 영상 처리 및 분석 스크립트를 삽입하여 분석하실 수 있습니다. 루프는 주어진 디렉토리에있는 모든 파일을 엽니다 이미지를 분석하고, Excel 파일과 같은 새 위치로 결과를 출력합니다.
- 집계 결과는 이미지에 표시된 해당 숫자와 함께, 같은 지역, 경계, 순환성, Feret의 직경, 각 아일릿에 대한 아일릿 중심지로 데이터를 저장, Excel 스프레드 시트에 저장됩니다.
전산 분석 및 히스토그램 설정
- 자동으로 시작되면 실행 Mathematica 스크립트는, 항목 수십만 amounting, 수집된 스프레드 시트 데이터를 처리하는 데 사용됩니다. 실행하는 핵심 프로세스 중 하나는 크기 분포를 조사하고 또한 데이터에 outliers를 결정하는 데 사용되는 히스토그램을 구성 주파수 분석입니다. 스크립트에서 총 아일릿 영역 측정 및 기타 매개 변수에 비해 특히 시간이 지점 또는 췌장의 나이에, 그리고 적절하게 그래프로 표시됩니다.
3. 2 차원 Immunohistochemically 스테인드 가상 슬라이스 이미지의 세 차원 재건
가상 조각의 3D 재건
- 해당 디렉토리 (즉, 폴더)로 스크립트를 ( "im_jp2_2_tiff") 복사jp2 이미지가 포함되어 있습니다. 콘솔에 "./im_jp2_2_tiff"를 입력한 다음 Enter 키를 눌러 리눅스 쉘과 함께 스크립트를 실행합니다. 이 스크립트를 실행하면 자동으로 가상 조각의 세 차원 스택의 건설, 부량에서 사용되는 형식입니다 TIFF 파일로 디렉토리에있는 jp2 이미지를 모두 변환합니다. (참고 :. 입력 "chmod를 + X im_jp2_2_tiff"제대로 실행할 수 있도록 스크립트로 텍스트 파일을 변환 스크립트가 실행되지 않는 경우)
- 촬영된 이미지의 모든 jp2에서 TIFF 파일 변환되었을 경우, 그들은 ImageJ에서 분석을 위해 사용될 준비가 된 것입니다.
- ImageJ와 함께, 첫번째 예제 (이 경우 다섯 이미지 : DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7)에 대한 이미지를 모두 열고 하나의 이미지 (이미지 → 색상 → 병합 채널)로 병합. 샘플 각각에 대해이 과정을 반복합니다. 샘플의 모든 단일 이미지로 통합되었을 경우, "다각형 선택"도구를 사용하여 원치 않는 영역을 선택하고 (편집 → 기입)에서 그들을 작성하여 이미지를 청소하십시오. (필요한 경우 작은 크기로 이미지를 크기 조정). 다음 RGB 컬러 이미지 (이미지 → 입력 → RGB 색상)으로 각각의 이미지를 변환합니다. 필요한 경우 마지막으로, 그들은 더 이상 "스택 등록"플러그인에 부합 수있는 후 (스택에 스택 이미지 → → 이미지) 이미지의 스택을 만들 수 있습니다. 궁극적으로, 채널을 합병 후 이미지를 결합하면 전체 췌장에있는 아일 레츠의 모든 3D 몽타주를 만듭니다. 이미지를 보려면, "3D 뷰어."다음 "플러그인"을 클릭하고
4. 아일릿 매핑
이미지 스택을 수집
- 현미경 전체 마운트 췌장 아일 레츠을 ...을 놓다.
- Slidebook 소프트웨어를 여십시오. "Ctrl + Shift + E."를 눌러 "캡처 및 제어를 초점"액세스 "초점 제어"창에서 아일릿의 크기에 따라 20X 또는 40X로 목표를 설정합니다. 물 침지 객관적인 렌즈를 사용하는 경우 물을 적용합니다.
- "초점 컨트롤"창에서 배 및 User1에 필터 설정을 설정하는 "빈"설정 아일 레츠를 찾을 수있는 현미경의 접안 렌즈를 사용하려면. "방출 선택은"100 % 눈 및 1 중립 밀도로 설정해야합니다. 다음 "GFP 어이"을 클릭 "열기 플루어합니다."
- Slidebook에서 샘플을 시각화하기 위해 초점으로 돌아갑니다 윈도우를 제어하고 "라이브"를 클릭하십시오 "필터 설정"스위치 "GFP DS를." 센터 카메라 한 윈도우에 아일릿뿐만 아니라 가능으로 조이스틱을 사용합니다. 어딘가 세포가 쉽게 분별 수 아일릿의 중심 근처의 깊이에 초점.
- 에서 "초점 컨트롤 창"에서 "Z 탭에서"을 선택하십시오. 기준점으로 현재의 깊이를 설정하는 윈도우의 왼쪽 상단에서 설정을 클릭합니다. 기능이 명확하게 분별 수있는 아일릿의 맨 위에 깊이으로 스크롤을 클릭하십시오 범위 컨트롤을 사용 "최고를 설정합니다." 아일릿의 하단으로 스크롤을 클릭 "설정 바텀." 참조 지점으로 돌아갑니다 "GO"를 클릭하십시오.
- 캡처 창에서 "배"를 "빈 팩터"를 설정하고 '필터 설정'설정 '라이브를. " "3D"(오직 3D)에 '캡처 형식 "을 설정합니다. 창의 오른쪽에 "상단 및 하단 위치를 사용합니다"를 클릭하십시오. 클릭 "캡처 후 포인트를 참조로 돌아가기." 에있는 "단계 크기"설정 "3."
- 아래 "필터 설정 상자"를 선택 DAPI dsu, GFP dsu, RFP dsu 및 Cy5 Dsu. 각각 들어, "노출을 조절"다음 선택한 노출 적합한지 확인하기 위해 "테스트"를 클릭 아래의 "최우수 찾기"를 클릭하십시오. 캡처를 시작하려면 "시작"을 클릭하십시오.
- 캡처가 완료되면 필요에 따라 레벨을 조정하고 흰색 RFP에 대한 표시 색상을 변경할 수 있습니다. 슬라이드를 저장하고 → 내보내기 → TIFF 시리즈를보기로 이동합니다. 끝에 대시로 슬라이드의 이름을 입력하고 저장합니다. 개별 TIFF 파일의 수십가 생성되며, 그것이 별도의 폴더에 각 아일릿의 이미지 스택을 유지하기 위해 도움이 될 수도 있습니다.
이미지 스택을 매핑
- 스테레오 탐정을 엽니다. 이미지 스택 (파일 → 이미지 → 이미지 스택 스택 열기) 열어 이미지를 시각화. 3.00 μm의에의 "이미지 스케일링 메뉴"SET "이미지 사이의 거리". Slidebook의 배 비닝에 대한 해결하려면 "무시 X와 Y의 스케일링"과 스케일링 "X와 Y의 출처에 대해 지정된 사용자"를 선택하고, X와 Y를 모두 0.65을 입력
- 에 대한 관심의 아일릿 중간에 클릭하여 센터 이미지 "매크로 창." 적절한 마커를 사용하여 하나 이상의 세포를 표시합니다. 베타 세포가 녹색으로 나타납니다, 알파 세포 붉은 나타납니다, 그리고 델타 세포가 흰색이 나타납니다; 사용 마커 2 (홀로 서클)는 알파 세포를 표시하는 베타 세포, 마커 5 (속이 빈 삼각형) 표시하고, 마커 6 ( 델타 세포에 빈 삼각형). 세포 샘플이 DAPI 물들일되어있다면 파란색으로 나타납니다들은 핵의 중앙에 표시되어야합니다.
- 적어도 하나의 세포가 표시되면, 상단 메뉴에있는 아이콘을 사용하여 "오르토고널보기"를 표시합니다. "Z - 필터"와 확인 "대칭을." 범위의신고해야할 15.00로 설정합니다. 0.0 Z 수준에서 시작, 마우스 휠을 사용하여 아일릿 스크롤하고 적절한 표시와 함께 각 셀에 표시. 각 세포는 그 깊이의 중심에 한 번만 표시되어야합니다. Z - 레벨의 각, "Z - 필터"확인란을 선택하지 수를 표시 마무리시. 이것은 Z - 레벨의 모든에서 마커의 모든 표시됩니다.
- 모든 세포가 표시되면, "DAT"파일 이름으로 파일을 저장 후 → 내보내기 추적을 파일로 이동합니다. "TXT"파일로 추적을 저장합니다. 새로운 아일 레츠를지도하기 전에 작업 영역을 취소합니다 "새 데이터 파일"을 클릭하십시오.
5. 대표 결과 :
immunohistochemically 스테인드 췌장 샘플 밖으로 가상 조각의 준비 (모두 함께 아일 레츠 (그림 1A)로 개별적으로 별도의 채널에서 전체 췌장에 (알파, 베타, 델타 - 전지) 내분비 세포의 모든 검사를 수 그림 1B). 컴퓨터 프로그램과 스크립트의 도움으로 대규모 데이터의 대량 분석은 이러한 가상 조각을 수행할 수 있습니다. 특히, 복합 마스크 (그림 1C)의 입자 분석 아일릿 지역, 경계 (주변 거리), 순환성 (1.0 완벽한 원형을 나타냅니다 진원도의 정도)과 같은 매개 변수를 포함하는 통계 테이블로 출력하고, 각 아일릿에 대한 Feret의 직경 (지역 가장 긴 거리) (그림 1D) 발견. 총 아일릿 번호와 사이즈 배포 histograms뿐 아니라 알파, 베타, 델타 세포 분야의 상세한 비교의 생산에서 이러한 이미지 결과의 대규모 분석. 또한, 각 가상 슬라이스는 약 5 μm의 깊이에서 찍은 있으며, 각각의 2D 가상 조각의 모든 추가 전체 췌장 샘플의 3 차원 재건을 만들 정렬됩니다. 아일릿 매핑은 3D에서 아일 레츠를 캡처뿐 아니라 또 다른 인스턴스를 보여줍니다뿐만 아니라 자세한 컴퓨터를 이용한 분석. 아일릿 매핑은 별개의 아일 레츠의 캡처 (그림 2A)과 마킹 이후 구성되어 알파, 베타, 델타 - 세포 다양한 Z - 비행기 (그림 2B)에서 3D로 아일릿 (그림 2C, D)을 시각화합니다. 매핑 아일 레츠의 자동 수학적 분석은 셀 셀 거리 (그림 2E)와 셀 - 셀 거리 배포판 (그림 2 층)의 누적 확률 포함한 세포 조성과 구조를 표시합니다.
그림 1. 가상 슬라이스를 사용하는 아일릿 배포판의 대규모 캡처 및 분석. 인간의 췌장 부분 A. 가상 슬라이스 볼 수 있습니다. A. 인슐린에 대한 Immunohistochemical 얼룩 (녹색), 글루카곤 (적색), somatostatin (흰색)와 DAPI (파란색). B. 자동 thresholding 이후 8 비트 마스크를 전환. 박스 지역은 각 채널의 BB보기에서 확대됩니다. A. 델타 세포, B. 베타 세포, C. 알파 - 세포와 D. 합성 이미지를 병합. C. 입자 분석 복합 마스크에 따라 수행했습니다. 작은 셀 클러스터 포함한 각 아일릿 구조 (파란색 강조 표시) 번호입니다. C.에 표시된 태그에 해당하는 ID가 각각의 구조물에 대한 측정 다양한 매개 변수 D. 통계 테이블,
그림 2. Immunohistochemical 가상 슬라이스 분석. 그림 1의 A. 차원 스캐터 줄거리는 같은 지역, 순환성 및 feret의 직경과 같은 매개 변수에 의해 각 아일릿의 크기와 모양 분포를 보여주는. 그림 1의 B. 3 차원 스캐터 줄거리는 셀룰러 아일릿 구성 및 크기를 보여주는. 그림 1에서 전체 인간 섹션 분석 C. 아일릿 크기 분포 lognormal 확률 밀도 분포에 장착되어. 세포 구성 비율 D. 수리 분석 (베타 세포에서 녹색, 파란색 빨간색과 델타 세포에서 알파 - 세포) 그림 1의 각 아일릿 효과 직경 빈하십시오. E. A. 무작위 표본 추출 immunohistochemical 분석 아일릿 크기 분포 (왼쪽). 가상 슬라이스 분석 아일릿 크기 분포 (오른쪽). B. 무작위 샘플링 immunohistochemical 분석 (적색)과 가상 슬라이스 (파란색)의 로그 정상적인 플롯 비교.
그림 3. 아일릿 매핑 및 세포 조성과 구조의 수학적 분석. A : 스테레오 - 인베스티게이터에 올린 인간 아일릿의 이미지의 3D 복원 스택 (빨간색 녹색, 알파 세포에서 베타 세포, 흰색 델타 - 세포, 그리고 파란색의 핵)에서 하나의 초점 비행기를 보여주는 화면 - 캡처 . B : 형광 이미지 (왼쪽)와 세 가지 초점 비행기에서 해당 매핑 데이터 (오른쪽) 10 μm의의 간격으로 표시됩니다. C : 3D 복원 아일릿 매핑 데이터의 대표 볼 수 있습니다. D : 아일릿 매핑하여 얻은 좌표에 따라 분기 - 썬 아일릿의 3D 재건. E : 세포 조성과 구조의 수학적 분석. L전자 송금 (EFT). 단세포 인구에서 두 세포 사이의 세포 - 세포 거리의 상대 주파수. 맞아. 서로 다른 두 가지 세포 집단 사이의 셀 - 셀 거리의 상대 주파수. F : Kolmogorov - 스미 르 노프 (KS) 테스트합니다. 왼쪽. 의 누적 확률 휴대 세포에 알파 - 투 - 알파에 대한 거리 배포판, 베타 - 투 - 베타, 델타 - 투 - 델타 세포. 맞아. 해당하는 세 누적 확률에 대한 KS 거리.
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Discussion
컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 부량 여기 췌장 아일릿 연구에서 4 가지 주요 포인트를 여유 제시 : (1) 췌장 표본의 대규모 분석 전체 아일릿 크기 분포 및 아일릿 아키텍처의 포괄적인 뷰를 제공합니다. (2) 세포 조성과 구조의 3 차원 재구성 및 수학적 분석은 더 아일릿 이내 내분비 세포의 공간적 배열의 시험을 용이하게합니다. (3) 서로 다른 종 간의 다양한 pathophysiological 조건 하에서 동일한 수종의 줬죠 아일릿 소성 오히려 종의 차이보다 신진 대사 변화에 대한 응답으로 evolutionarily 획득한 적응을 제안할 수 있습니다. (4) 특정 유전자 발현의 변화와 함께 내분비 세포 조성과 아일릿 아키텍처의 다시 정리하기는 더욱 intraislet의 내분비 세포 네트워크의 역할의 중요성을 제시의 기능 속성에 아일릿 적응을 반영될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는에서 지원하는 미국 보건 서비스 그랜트 DK - 081527, DK - 072473 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터 (동물 모델 코어) 대학 및 Kovler 가족 재단에서 선물 DK - 20595.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | IX-81 | |
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus |
References
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition. ISLETS. 2, 135-145 (2010).
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. Islet architecture - a comparative study. ISLETS. 1, 129-136 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
