Datorstödd Storskaliga Visualisering och kvantifiering av bukspottkörtel Islet Mass, storleksfördelning och Arkitektur

Summary

Nya datorstödda metoder för upphandling i stor skala och analys av immunhistokemiskt färgade bukspottskörteln prover beskrivs: (1) Virtual Skiva tillfångatagande av hela avsnittet, (2) Mass analys av stora mängder data, (3) Rekonstruktion av 2D Virtual Slices , (4) 3D holme kartläggning, och (5) Matematisk analys.

Abstract

Den pankreas holme är en unik mikroorganismer består av flera endokrina hormoner celler som utsöndrar såsom beta-cellerna (insulin), alfa-celler (glukagon), och delta-celler (somatostatin) som är inbäddade i de exokrina vävnader och omfattar 1 - 2% av hela bukspottkörteln. Det finns ett nära samband mellan kropp och bukspottkörtel vikt. Totalt beta-cellmassan ökar också proportionellt för att kompensera för efterfrågan på insulin i kroppen. Vad undgår denna proportion expansionen är storleken fördelningen av holmar. Stora djur som människor har liknande distributioner holme storlek med möss, vilket tyder på att detta mikroorganismer har en viss storleksgräns att vara funktionella. Oförmågan av stora djur pancreata att generera proportionellt större holmar kompenseras av en ökning av antalet holmar och genom en ökning av andelen större holmar i deras övergripande holme storleksfördelning. Dessutom skär uppvisar en slående plasticitet i cellulär sammansättning och arkitektur mellan olika arter och även inom samma art under olika patofysiologiska förhållanden. I den aktuella studien beskriver vi nya metoder för analys av biologiska bilddata för att underlätta automatisering av analytiska processer som gör det möjligt för analys av stora och heterogena data samlingar i studien av sådana dynamiska biologiska processer och komplexa strukturer. Sådana studier har försvårats på grund av tekniska svårigheter objektiva provtagning och generera stora datamängder att exakt fånga komplexiteten i biologiska processer av holme biologi. Här visar vi metoder för att samla in objektiva "representativa" uppgifter inom den begränsade tillgången av prover (eller minimera provtagning) och standardavvikelsen experimentella inställningar och att exakt analysera de komplexa tredimensionella strukturen av holmen. Datorstödd automation möjliggör insamling och analys av stora datamängder och även garanterar objektiva tolkning av data. Dessutom exakt kvantifiering av holmen storleksfördelning och rumsliga koordinater (dvs X, Y, Z-positioner) inte bara leder till en korrekt visualisering av bukspottkörtelns holmen struktur och sammansättning, men också tillåter oss att identifiera mönster under utveckling och anpassning till att förändra förhållanden genom matematisk modellering. De metoder som utvecklats i denna studie kan tillämpas på studier av många andra system och organismer som väl.

Protocol

1. Skapa Virtuella skivor immunhistokemiskt Stained bilder

1. Öppna StereoInvestigator. Placera de rena bilden håller provet i mikroskop hållaren och visualisera det i Stereo Utredare genom att klicka på "Förvärvet" och sedan "Live Image" (Acquisition → Live Image). Bestäm exponeringsnivåer för varje kanal, i vårt specifika exempel Kanal 2 används för DAPI, Kanal 3 för GFP, Channel 4 för RFP, Kanal 5 för Cy5 och Kanal 6 för Cy7. Använd "Video Histogram"-fönstret, som visar intensiteten i fluorescens, för att bestämma exponeringen. Lämpliga fluorescens intensitet har uppnåtts när intensiteten avtar till höger slutet av videon Histogram. Exponeringsnivåer kan ändras i "Kamerainställningar"-fönstret. Video Histogram kan fokuseras med mikroskop fokus hjulet.
2. Innan du skapar en virtuell Slice, kontur provet genom att klicka på skärmen vid en punkt bort från provet, vilket markerar en referenspunkt, och sedan klicka runt konturerna av provet. När konturen är klar, högerklicka och välj "Stäng Kontur" för att ansluta början och slutpunkt.
3. När konturen är stängt, fånga en virtuell Skiva för provet (Förvärv → Hämta Virtual Slice). När den virtuella Slice fönstret alternativ öppna, välj "High Speed ​​Hämta" samt automatisk fokusering genom att avmarkera rutan bredvid "Manuell". Spara filen.
4. Den virtuella skiva prefocus måste kalibreras genom att välja (högerklicka → Lägg till Focus Site List) och manuellt fokus flera slumpmässiga sektioner,, dvs platser i den virtuella Slice förhandsvisning. När flera platser har fokuserat, starta den virtuella Slice (högerklicka → Starta Virtual Slice med Prefocus). Efter den virtuella Slice för det första provet är klar, växlar till nästa kanal och justera exponeringen därefter. Upprepa steg 4 och 5 för varje kanal.

2. Datorstödd tvådimensionell analys

Kvantifiering av Islets

1. Bilderna bearbetas sedan med hjälp av en ImageJ makro som heter "IHCVS", som först förbereder laddade bilder för analys och sedan kvantifierar funktioner holmar såsom cellulär sammansättning (dvs. varje område av beta-, alfa-, och delta-cellpopulationer och holme område vid den summa värde). Bunten är uppdelad i sina separata kanaler i ImageJ, där varje enskild kanal visar en separat bild baserad på immunhistokemisk färgning. Varje bild är då automatiskt thresholded, varefter en 8-bitars svartvit bild, eller en mask, av thresholded bilden produceras. De separata kanal bilderna läggs sedan ihop matematiskt i en sammansatt mask, och ImageJ: s inbyggda partikel analys utförs på den sammansatta bilden.
2. ROI är då identifieras medan exklusive partiklar mindre än en enstaka betaceller (<170 ìm ^2, området beräknas med en diameter på ~ 15 ìm, Hara et al, 2003.). Den resulterande ROI analyseras och kvantifieras med hjälp ImageJ, kvantifiering kan innehålla omkrets (ett avstånd omger ett område), rund (en viss rundhet där antalet 1,0 skildrar en perfekt cirkel), Féret diameter (det längsta avståndet inom ett område) och centrum koordinaterna för varje analyserat regionen så att den lilla ön distributionen matematiskt kan analyseras med olika kombinationer av dessa parametrar och ritade i ett 3D-diagram, där uppgifterna kommer att användas för matematisk modellering. En enda virtuell skiva bilden analyseras i 30 sekunder. Flera bilder kan analyseras genom att bädda för bildbehandling och analys av manus i en loop syntax som stöds av ImageJ makrospråk. Loopen öppnar alla filer i en viss katalog, analyserar bilder och utgångar leder till en ny plats som en Excel-fil.
3. De aggregerade resultat sparas i ett Excel-ark, lagra data såsom area, omkrets, cirkularitet, Féret diameter, och holme centrum för varje holme, tillsammans med motsvarande siffror märkta i bilden.

Computational Analys och Histogram Setup

1. Mathematica skript som körs automatiskt en gång började, används för att bearbeta kalkylbladet insamlade data, som uppgår till hundratusentals poster. En av de kritiska processer som körs är en frekvensanalys, som bygger ett histogram används för att undersöka storleksfördelning och även bestämma extremvärden i data. Enligt manus, är totalt holme område mätas och jämföras med andra parametrar, särskilt till tidpunkter eller ålder i bukspottkörteln, och sedan följaktligen visas i en graf.

3. Tredimensionell rekonstruktion av tvådimensionella immunhistokemiskt Målat Virtual Slice bilder

3D-rekonstruktion av Virtual Slices

1. Kopiera skriptet ("im_jp2_2_tiff") i katalogen (dvs, mapp) sominnehåller JP2 bilder. Kör skriptet med Linux-skalet genom att skriva "./im_jp2_2_tiff" i konsolen och sedan trycka på Enter. Köra skriptet kommer automatiskt konvertera alla JP2 bilderna i katalogen till TIFF-filer, vilket är det format som används vid konstruktion och kvantifiering av tredimensionella staplar från den virtuella skivor. (OBS:. Skriv in "chmod + x im_jp2_2_tiff" om skriptet inte körs, vilket kommer att konvertera textfilen till ett skript så att den kan köras)
2. När alla de tagna bilderna har konverterats från JP2 till TIFF-filer, de är redo att användas för analys i ImageJ.
3. Med ImageJ, öppna alla bilderna för det första provet (fem bilder i det här fallet: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) och slå samman dem som en bild (Bild → Färg → Merge kanaler). Upprepa denna process för varje prov. När alla prover har kombinerats som enstaka bilder, rengör bilder genom att välja oönskade områden med "polygon Selections" verktyg och fylla dem i (Redigera → Fyll). (Ändra storlek på bilder till en mindre storlek, om det behövs). Konvertera sedan varje bild till ett RGB bild (Bild → Typ → RGB). Slutligen, skapa en stack ut ur bilderna (Bild → travar → bilden för att Stacks), varefter de ytterligare kan anpassas till "Stack Reg" plugin om det behövs. Ytterst sammanslagning av kanaler och sedan kombinera bilderna skapar en 3D-montage av alla holmar i hela bukspottkörteln. För att visa bilden, klicka på "Plugins" och sedan "3D-visningen."

4. Holme Kartläggning

Samla Bildstaplar

1. Placera hela holmar montera bukspottkörteln under mikroskop.
2. Öppna Slidebook programvara. Gå till "Fånga och Focus Control" genom att trycka "Ctrl + Shift + E." I "Fokus Control"-fönstret, fastställde målet att 20X eller 40X, beroende på storleken på holmen. Applicera vatten om med en vatten-objektiv nedsänkning mål.
3. För att kunna använda mikroskop okularet att lokalisera holmar, som "Bin" till 2x och ställ inställt filter User1 i "Fokus Controls"-fönstret. "Emission Selection" bör sättas till 100% Ögon och Neutral Density till 1. Klicka på "GFP ey" och sedan "Öppna Fluor".
4. För att visualisera provet i Slidebook, tillbaka till Fokus Controls-fönstret och växla "Filter Set" till "Live" och klicka på "GFP ds." Använd styrspaken för att centrera holme i Kamera 1 fönster så bra som möjligt. Fokusera till ett djup någonstans nära mitten av ön, där cellerna kan skönjas enkelt.
5. I "Fokus Controls Window", välj "Z-fliken." Klicka in i övre vänstra hörnet av fönstret för att ställa in aktuellt djup som en referenspunkt. Använd utrymme för att bläddra till den översta djup holmen i vilka funktioner kan urskiljas tydligt och klicka på "Set Top". Bläddra till slutet av ön och klicka på "Ställ Bottom". Klicka på "Go" för att återgå till referenspunkten.
6. I Capture-fönstret, som "Bin Factor" till "2X" och ställ in "Filter Set" till "Live". Ställ in "Capture Type" till "3D" (och enda 3D). På höger sida av fönstret, klicka på "Använd toppen och botten positioner." Klicka på "Return to Reference punkt efter Capture." Ställ in "Step Size" till "3".
7. Under "Filter Set Box", välj DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU och Cy5 DSU. För var och en, klicka på "Hitta bästa" under "Justera exponering", klicka sedan på "Test" för att kontrollera att den valda exponeringen är lämplig. Klicka på "Start" för att börja fånga.
8. När capture är klar justera nivåerna som behövs och ändra den visade färgen för RFP till vit. Spara bilden och gå till Visa → Exportera → TIFF-serien. Skriv in namnet på bilden med ett streck i slutet och spara det. Dussintals individuella TIFF-filer skapas, så det kan vara bra att hålla varje holme image stack i en separat mapp.

Kartläggning Bildstaplar

1. Öppna Stereo utredare. Visualisera bilden genom att öppna bilden staplar (Arkiv → bildstapel → bildstapel Open). I "Image Scaling menyn" set "Avstånd mellan bilder" till 3,00 ìm. Att korrigera för 2X binning i Slidebook, välj "Åsidosätt X och Y Scaling" och "Användare Specificerad för källa X och Y" Skalning och anger 0,65 för både X och Y.
2. Centrera bilden genom att klicka i mitten av den lilla ön intresse för "Macro-fönstret." Markera minst en cell med hjälp av lämplig markör. Beta-cellerna kommer att visas grönt, kommer alfa-celler, tycks rött, och delta celler visas vitt, använder Marker 2 (en ihålig cirkel) för att markera beta-celler, Marker 5 (en ihålig triangel) för att markera alfa-celler, och Marker 6 ( en ihålig triangel) för att delta celler. Celler bör märkas i centrum av deras kärna, som visas blå om provet har färgats med DAPI.
3. När minst en cell har markerats, visas "Ortogonal Visa" med ikonen i toppmenyn. Kryssa i "Z-filter" och "Symmetrisk." Utbudet ärhould sättas till 15,00. Börja på 0,0 Z-nivå, bläddra genom holmen med hjälp av mushjulet och markera varje cell med lämplig markör. Varje cell ska vara märkt endast en gång i centrum för dess djup. Vid efterbehandling märkning varje Z-nivåer, "Z-filter" rutan kan okontrollerat. Detta kommer att visa alla markörer från alla Z-nivåerna.
4. När varje cell har markerats, spara filen som en "DAT" filen, gå sedan till Arkiv → Exportera spårning. Spara spårning som en "txt" fil. Klicka på "ny datafil" för att rensa arbetsytan innan du försöker att kartlägga nya holmar.

5. Representativa resultat:

Beredningen av virtuella skivor ur en immunhistokemiskt färgade bukspottkörteln prov kan man undersöka alla de endokrina celler (alfa, beta och delta-celler) i hela bukspottkörteln, både tillsammans som holmar (Figur 1A) och individuellt i separata kanaler ( Figur 1B). Med hjälp av datorprogram och skript kan en massa analys av stora mängder data utföras på dessa virtuella skivor. Närmare bestämt är en partikel analys av sammansatta masker (Figur 1C) ut som en statistik tabell som innehåller sådana parametrar som holme area, omkrets (avståndet omger ett område), rund (en viss rundhet, där 1,0 representerar en perfekt cirkel), och Féret diameter (det längsta avståndet inom ett område) för varje holme upptäcks (figur 1D). Den storskaliga analyser av dessa bilder resulterar i produktionen av totala holmen antal och storlek histogram distribution samt en detaljerad jämförelse av alfa-, beta-, och delta-cell områden. Dessutom är varje virtuell Skiva tas på ett djup av ca 5 ìm, och alla enskilda 2D Virtuella Slices är ytterligare staplas för att skapa en 3D rekonstruktion av hela bukspottkörtelns provet. Islet kartläggning visar en annan instans inte bara att fånga holmar i 3D, men också av detaljerade datorstödd analys. Islet kartläggning består av att fånga olika holmar (Figur 2A) och den efterföljande märkning av alfa-, beta-, och delta-celler som på olika Z-plan (Figur 2B) för att visualisera en holme i 3D (Figur 2C, D). Automatiserad matematisk analys av kartlagda holmar visar deras cellulära sammansättning och arkitektur, inklusive cell-cell avstånd (Figur 2E) och kumulativa sannolikheterna för cell-cell avstånd distributioner (Figur 2F).

Figur 1. Storskaliga fånga och analys av holmen distribution via Virtual Slice. A. Virtuella skiva syn på en människa pankreas avsnitt. A. Immunhistokemisk färgning för insulin (grön), glukagon (röd), somatostatin (vit) och DAPI (blå). b. Konverterat 8-bitars mask efter automatisk tröskeleffekt. En boxed området är förstorat i BB Visningar för varje kanal. A. Delta-celler, f. beta-cellerna, c. alfa-celler, och d. samman sammansatt bild. C. Partikel analys på komposit mask. Observera att varje holme strukturer, inklusive småcellig kluster är numrerade (blå markera). D. Statistik tabell över olika parametrar mäts för enskilda konstruktioner, som har ID som motsvarar taggarna visas i C.

Figur 2. Analys av Immunhistokemisk Virtual Slice. A. 3D punktdiagram i figur 1 visar storleken och formen täckning för varje holme av parametrar som område, cirkularitet och Féret diameter. B. 3D punktdiagram av Figur 1 visar cellulära holme sammansättning och storlek. C. Islet storleksfördelning hela den mänskliga avsnittet analys från figur 1 monterad på en lognormala sannolikhetstäthet distribution. D. Matematisk analys av cellulära sammansättning nyckeltal (beta-cellerna i grönt, alfa-cellerna i rött och delta-celler i blått) för varje holme effektiva diameter bin i figur 1. E. A. Islet storleksfördelning av stickproven immunhistokemisk analys (till vänster). Islet storleksfördelning av virtuell skiva analys (höger). b. Log-normal tomt jämförelse av stickprov immunhistokemisk analys (röd) och virtuella slice (blå).

Figur 3. Islet kartläggning och matematisk analys av cellulära sammansättning och arkitektur. A: Screen capture visar en fokalplanet från en 3D-rekonstruerade bunt bilder av en människa skär upp i stereo-Investigator (beta-cellerna i grönt, alfa-cellerna i rött, Delta-celler i vitt och kärnor i blått) . B: Fluorescence bilder (vänster) och motsvarande mappade data (till höger) i tre olika fokalplan visas med ett intervall på 10 mikrometer. C: representativ bild av 3D-rekonstruerade uppgifter holme kartläggning. D: 3D-rekonstruktion av kvartalet skivade-holme baserat på de koordinater som erhållits genom holme kartläggning. E: Matematisk analys av cellulära sammansättning och arkitektur. LEFT. Relativ frekvens av cell-cell avstånd mellan två celler i en enda cell population. Höger. Relativ frekvens av cell-cell avstånd mellan två olika cellpopulationer. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) test. Vänster. Kumulativa sannolikheter för cell-till-cell avstånd distributioner för alfa-to-alfa-, beta-to-beta, och delta-till-Delta celler. Höger. KS avstånd för motsvarande tre kumulativa sannolikheter.

Discussion

Den datorstödda storskaliga visualisering och kvantifiering som presenteras här har råd med fyra centrala punkter i studier bukspottkörtelns ö: (1) En omfattande analys av bukspottskörteln prover ger en övergripande bild av hela holmen storleksfördelning och holme arkitektur. (2) De 3D-rekonstruktion och matematisk analys av cellulära sammansättning och arkitektur ytterligare underlätta granskningen av rumsliga arrangemang av endokrina celler i en holme. (3) Striking holme plasticitet mellan olika arter och i samma art under olika patofysiologiska förhållanden kan tyda på evolutionärt förvärvade anpassning till följd av metabola förändringar, snarare än artskillnader. (4) Omdisponering av endokrina cellulära sammansättning och holme arkitektur, tillsammans med förändringar i vissa genuttryck kan återspegla holme anpassning i dess funktionella egenskaper, vilket ytterligare tyder på betydelsen av den roll som intraislet endokrina Cell Network.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook		Program	Olympus