Summary
Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.
Abstract
A ilhota do pâncreas é um órgão único micro-composto de várias células secretoras de hormônio endócrino, tais como células-beta (de insulina), alfa-células (glucagon), e células-delta (somatostatina) que são incorporados nos tecidos exócrinas e compreendem 1 - 2% do pâncreas inteiro. Há uma estreita correlação entre o corpo eo peso do pâncreas. Massa das células beta total também aumenta proporcionalmente para compensar a demanda por insulina no organismo. O que escapa dessa expansão proporcional é a distribuição de tamanho de ilhotas. Animais de grande porte, tais como os seres humanos compartilham distribuições de ilhotas de tamanho similar com camundongos, sugerindo que este órgão tem um micro-determinado limite de tamanho para ser funcional. A incapacidade dos animais de grande porte pancreata para gerar ilhotas proporcionalmente maior é compensado por um aumento no número de ilhotas e por um aumento na proporção de ilhotas maior em sua distribuição geral das ilhotas tamanho. Além disso, ilhotas exibem uma plasticidade impressionante na composição celular e arquitetura entre diferentes espécies e também dentro da mesma espécie em diferentes condições fisiopatológicas. No presente estudo, descrevemos novas abordagens para a análise de dados de imagem biológica, a fim de facilitar a automação de processos analíticos, que permitem a análise de coletas de dados grandes e heterogêneas no estudo de processos biológicos, tais dinâmicas e estruturas complexas. Tais estudos foram prejudicados devido a dificuldades técnicas de amostragem imparcial e gerando grande escala conjuntos de dados precisamente captar a complexidade dos processos biológicos da biologia das ilhotas. Aqui nós mostramos métodos para coletar imparciais "representante" de dados dentro da disponibilidade limitada de amostras (ou para minimizar a coleta de amostras) e as configurações padrão experimental, e analisar com precisão a estrutura tridimensional e complexa do ilhéu. Assistida por computador a automação permite a recolha e análise de conjuntos de dados em grande escala e também assegura a interpretação imparcial dos dados. Além disso, a quantificação precisa da distribuição de tamanho das ilhotas e coordenadas espaciais (ou seja, X, Y, Z-posições), não só leva a uma visualização precisa da estrutura das ilhotas pancreáticas e composição, mas também nos permite identificar padrões durante o desenvolvimento e adaptação às condições alterando através da modelagem matemática. Os métodos desenvolvidos neste estudo são aplicáveis a estudos de muitos outros sistemas e organismos também.
Protocol
1. Criar Slices Virtual de imunohistoquímica Imagens Stained
- StereoInvestigator aberto. Coloque a lâmina limpa segurando a amostra no porta-microscópio e visualizá-lo em Stereo Investigator, clicando em "Aquisição" e depois "Image Live" (Image Acquisition → Live). Determinar níveis de exposição para cada canal, em nosso exemplo específico, o Canal 2 é usado para DAPI, Canal 3 para GFP, Channel 4 para a RFP, Channel 5 para Cy5 e Canal 6 para Cy7. Use o "Video Histograma" janela, que exibe a intensidade da fluorescência, para determinar o nível de exposição. Apropriada intensidades de fluorescência são alcançados quando as caudas intensidade fora na extremidade direita do histograma de vídeo. Níveis de exposição pode ser alterado na "Camera Settings" janela. O Histograma de vídeo podem ser focado com a roda de foco do microscópio.
- Antes de criar um Slice Virtual, contorno da amostra clicando na tela em um ponto de distância da amostra, que marcará um ponto de referência, e em seguida, clicando em todo o contorno da amostra. Quando o contorno é completa, clique direito e selecione "Contour Close" para ligar os pontos inicial e final.
- Uma vez que o contorno é fechado, a captura de um Virtual Slice para a amostra (Aquisição → Adquirir Slice Virtual). Quando as opções Slice Virtual janela aberta, selecione "Alta Velocidade Adquirir", bem como foco automático, desmarcando a caixa ao lado de "Manual". Salve o arquivo.
- A fatia virtuais pré-focagem deve ser calibrado, selecionando (botão direito → Adicionar à Lista Foco Site) e manualmente focando várias seções aleatória, ou seja, sites, na pré-visualização Slice Virtual. Quando vários sites têm sido focados, inicie o Slice Virtual (clique direito → Iniciar Slice Virtual com Pré-focagem). Após a Slice Virtual para a primeira amostra estiver completa, mudar para o canal seguinte e ajustar a exposição de acordo. Repita os passos 4 e 5 para cada canal.
2. Assistida por computador Análise Bidimensional
Quantificação de Ilhotas
- As imagens são então processadas usando uma macro ImageJ chamado "IHCVS", que primeiro se prepara imagens carregadas para análise e, em seguida, quantifica características de ilhotas como a composição celular (ou seja, cada área de beta, alfa-e delta-célula populações e ilhotas área no valor da soma). A pilha é dividida em canais separados em ImageJ, onde cada canal mostra uma imagem separada com base na coloração imuno-histoquímica. Cada imagem é então automaticamente thresholded, após o qual uma imagem de 8 bits em preto e branco, ou uma máscara, da imagem thresholded é produzido. As imagens canal separado são somados aritmeticamente em uma máscara composta, e análise de partículas ImageJ built-in é efectuado na imagem composta.
- ROIs são então identificadas, excluindo partículas menores que uma célula beta única (<M 170 2; área calculada usando um diâmetro de ~ 15 mm; Hara et al, 2003).. Os ROIs resultantes são analisados e quantificados utilizando ImageJ; quantificação pode incluir perímetro (uma distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde o número de 1,0 descreve um círculo perfeito), diâmetro Feret (a maior distância dentro de uma área) e centro coordenadas para cada região analisada, para que a distribuição das ilhotas podem ser analisados matematicamente usando várias combinações desses parâmetros e plotados em um gráfico 3D, os dados dos quais serão utilizados para modelagem matemática. Uma imagem única fatia virtual é analisado em 30 segundos. Várias imagens podem ser analisadas através de encaixar o processamento de imagem e roteiro de análise em uma sintaxe de loop suportado pelo ImageJ linguagem macro. O laço abre todos os arquivos em um determinado diretório, analisa as imagens, e saídas resultados em um novo local como um arquivo de Excel.
- Os resultados agregados são salvos em uma planilha do Excel, armazenamento de dados como área, perímetro, circularidade, diâmetro Feret, e centro para cada ilhota ilhota, junto com números correspondentes rotulados na imagem.
Análise computacional e Setup Histograma
- Scripts Mathematica, que funcionam automaticamente, uma vez iniciados, são utilizados para processar os dados da planilha coletados, no valor de centenas de milhares de entradas. Um dos processos críticos que são executados é uma análise de freqüência, que constrói um histograma usado para examinar distribuição de tamanho e também para determinar outliers nos dados. De acordo com o roteiro, a área total de ilhotas é medido e comparado a outros parâmetros, sobretudo a pontos de tempo ou a idade do pâncreas, e, em seguida, de acordo apresentada em um gráfico.
3. Reconstrução tridimensional de Dois Dimensional imunohistoquímica Stained Imagens Slice Virtual
Reconstrução 3D de Fatias Virtual
- Copie o script ("im_jp2_2_tiff") para o diretório (ou seja, pasta) quecontém o jp2 imagens. Executar o script com o shell do Linux digitando "./im_jp2_2_tiff" no console e pressionando enter. Este script irá converter automaticamente todos os jp2 imagens no diretório em arquivos de tiff, que é o formato usado na construção e quantificação de pilhas tridimensionais do Fatias Virtual. (Nota:. Digite "chmod + x im_jp2_2_tiff" se o script não for executado, o que irá converter o arquivo de texto em um script para que ele possa funcionar corretamente)
- Quando todas as imagens capturadas foram convertidos para arquivos de jp2 tiff, eles estão prontos para ser usados para análise em ImageJ.
- Com ImageJ, abra todas as imagens para a primeira amostra (cinco imagens neste caso: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) e fundi-los como uma imagem (Imagem → Cor → Mesclar canais). Repita esse processo para cada uma das amostras. Quando todas as amostras foram combinadas como únicas imagens, limpar as imagens, selecionando regiões indesejadas com o "Polígono Selections" ferramenta e enchendo-os em (Editar → Fill). (Redimensionar as imagens para um tamanho menor, se necessário). Em seguida, converter cada imagem em uma imagem de cor RGB (Imagem → → Tipo de cor RGB). Finalmente, criar uma pilha a partir de imagens (Image → Imagem → para Stacks Stacks), após o que pode ainda estar alinhado com o "Stack Reg" plugin, se necessário. Em última análise, a fusão dos canais e, em seguida, combinando as imagens cria uma montagem 3D de todas as ilhotas no pâncreas inteiro. Para ver a imagem, clique em "Plugins" e então "visualizador em 3D."
4. Mapeamento Islet
Coleta de Pilhas de imagens
- Situar as ilhotas pancreáticas toda montagem sob o microscópio.
- Abra o software Slidebook. O acesso a "Captação e Controle de Foco" pressionando "Ctrl + Shift + E." No "Controle de Foco" janela, defina o objetivo de 20X ou 40X, dependendo do tamanho da ilhota. Aplique água se estiver usando uma lente objetiva de imersão de água.
- A fim de utilizar a ocular do microscópio para localizar ilhotas, set "Bin" para 2X e definir o conjunto de filtros para User1 na "Controles Focus" janela. "Seleção de Emissão" deve ser ajustado para Olhos 100% e densidade neutra para 1. Clique em "GFP ey" e depois "Open Fluor."
- Para visualizar a amostra em Slidebook, volte para o Focus Controles janela e switch "Set Filter" para "Live" e clique em "boas práticas agrícolas ds". Use o joystick para o centro da ilhota na janela Camera 1, bem como possível. Foco para uma profundidade em algum lugar perto do centro da ilhota, onde as células podem ser distinguidas facilmente.
- Na "Janela controla o foco", selecione a guia "Z". Clique set no canto superior esquerdo da janela para definir a profundidade atual como um ponto de referência. Use o controle de escopo para se deslocar até a profundidade superior da ilhota em que recursos podem ser discernido claramente e clique em "Set Top". Vá até o final do ilhéu e clique em "Bottom Set". Clique em "Go" para voltar ao ponto de referência.
- Na janela de captura, set "Fator de Bin" para "2X" e definir "Set Filter" para "Live". Definir o "Tipo de Captura" para "3D" (e só em 3D). No lado direito da janela, clique em "Use Posições Superior e Inferior." Clique em "Return to Ponto de Referência após a captura." Definir o "Tamanho do Passo" para "3".
- Sob o "Box Set Filter," select DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU, e Cy5 Dsu. Para cada uma, clique em "Find Best" em "Ajuste da exposição", depois clique em "Test" para se certificar de que a exposição seleccionado é apropriado. Clique em "Iniciar" para iniciar a captura.
- Quando a captura for concluída, ajustar os níveis como necessárias e mudar a cor exibida para RFP para branco. Salvar o slide e vá em Exibir → Exportar → TIFF série. Digite o nome do slide com um traço no final e salvá-lo. Dezenas de arquivos TIFF individuais são criados, por isso pode ser útil para manter a pilha de cada ilhota de imagem em uma pasta separada.
Mapeamento Stacks Imagem
- Abra Investigador Stereo. Visualize a imagem abrindo as pilhas de imagens (Arquivo → Stack Stack Imagem Imagem → Open). No "menu Escala de imagem," set "distância entre as imagens" para 3,00 mM. Para corrigir binning 2X em Slidebook, selecione "Override X e Y Scaling" e "usuário especificado para Fonte de X e Y" Scaling, e digite 0,65 para ambos X e Y.
- Centralizar a imagem clicando no meio da ilhota de interesse na "janela Macro." Marcar pelo menos uma célula usando o marcador apropriado. Células-beta aparecerá verde, células alfa aparecerá vermelho, e as células delta aparecerá branco; marcador use 2 (um círculo vazio) para marcar as células-beta, Marker 5 (um triângulo oco) para marcar as células alfa, e Marker 6 ( um triângulo vazio) para as células delta. Células devem ser marcadas no centro de seu núcleo, que aparecem em azul se a amostra foi corado com DAPI.
- Uma vez que pelo menos uma célula tem sido marcado, exibir o "Ver Orthogonal" usando o ícone no menu superior. Marque a opção "Z-Filter" e "Symmetric". O s gamahould ser ajustado às 15h00. Começando no nível 0,0 Z, percorra a ilhota usando a roda do mouse e marcar cada célula com o marcador apropriado. Cada célula deve ser marcada apenas uma vez no centro da sua profundidade. Ao terminar marcando cada um dos níveis-Z, o "Z-filtro" checkbox pode ser desmarcada. Isto irá mostrar todos os marcadores de todos os Z-níveis.
- Quando cada célula tem sido marcada, salve o arquivo como um "DAT" arquivo, então vá ao menu Arquivo → Exportar Tracing. Salvar o rastreamento como uma "TXT" arquivo. Clique em "novo arquivo de dados" para limpar o espaço de trabalho antes de tentar mapa ilhotas novo.
5. Resultados representativos:
A preparação de fatias Virtual a partir de uma amostra de pâncreas imunohistoquímica manchada capacita a pessoa a examinar todas as células endócrinas (alfa, beta e delta-células) no pâncreas todo, tanto em conjunto como ilhotas (Figura 1A) e individualmente em canais separados ( Figura 1B). Com o auxílio de programas de computador e scripts, uma análise de massa de dados em grande escala podem ser realizadas sobre essas fatias Virtual. Especificamente, a análise de partículas de máscaras composto (Figura 1C) é a saída como uma tabela contendo estatísticas parâmetros como ilhéu área, perímetro (a distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde 1.0 representa um círculo perfeito), e Feret diâmetro (a maior distância dentro de uma área) para cada ilhota detectado (Figura 1D). A análise de larga escala destes resultados imagens na produção do número de ilhotas total e histogramas distribuição de tamanho, bem como uma comparação detalhada de alfa-, beta-e delta-célula áreas. Além disso, cada Slice Virtual é levado a uma profundidade de aproximadamente 5 mm, e todos do indivíduo 2D Slices Virtual são ainda empilhadas para criar uma reconstrução 3D da amostra de pâncreas inteiro. Mapeamento das ilhotas demonstra outra instância, não só de capturar ilhotas em 3D, mas também de análise assistida por computador detalhadas. Mapeamento de ilhotas consiste na captura de ilhotas distintos (Figura 2A) ea subsequente marcação de alfa, beta-e delta-células em várias Z-aviões (Figura 2B) para visualizar uma ilhota em 3D (Figura 2C, D). Análise matemática automatizado de ilhotas mapeadas exibe sua composição celular e arquitetura, incluindo a célula-distâncias (Figura 2E) e distribuições de probabilidades cumulativas de célula-distância (Figura 2F).
Figura 1. Grande escala de captura e análise da distribuição das ilhotas usando Slice Virtual. A. slices Virtual de uma seção de pâncreas humano. a. Coloração imuno-histoquímica de insulina (verde), glucagon (vermelho), somatostatina (branco) e DAPI (azul). b. Convertidos de 8 bits da máscara após limiarização automática. A área de box é ampliado no BB Visualizações de cada canal. a. delta-células, b. células-beta, c. alfa-células, e d. fundiram imagem composta. C. A análise da partícula efectuadas sobre máscara de composto. Note-se que cada estrutura de ilhotas incluindo grupos de células pequenas é numerado (destaque em azul). D. Estatísticas tabela de vários parâmetros medidos para estruturas individuais, que têm IDs que correspondem às etiquetas mostrado na C.
Figura 2. Análise de Slice Virtual imuno-histoquímica. A. gráfico de dispersão 3D da Figura 1 mostra o tamanho ea forma de distribuição de cada ilhota por parâmetros como área, circularidade e diâmetro Féret. B. gráfico de dispersão 3D da Figura 1 mostra a composição celular das ilhotas e tamanho. C. distribuição de tamanho de Islet da análise seção inteira humana a partir da Figura 1 equipado com uma distribuição lognormal densidade de probabilidade. D. Análise Matemática dos rácios de composição celular (células-beta em verde, as células alfa-delta em vermelho e as células em azul) para cada bin diâmetro das ilhotas eficaz da Figura 1. E. a. Islet distribuição de tamanho de análise de amostragem aleatória imuno-histoquímica (esquerda). Islet distribuição de tamanho de análise fatia virtual (direita). b. Log-normal comparação trama de análise de amostragem aleatória imuno-histoquímica (vermelho) e fatia virtual (azul).
Figura 3. Islet mapeamento e análise matemática da composição celular e arquitetura. A: captura de tela que mostra um único plano focal de uma pilha de reconstrução 3D de imagens de uma ilhota humano carregado em Stereo Investigator (beta-células em verde, alfa-células em vermelho, delta-células em branco, e núcleos em azul) . B: imagens de fluorescência (esquerda) e correspondentes dados mapeados (direita) em três diferentes planos focais mostrado em um intervalo de 10 mM. C: Vista Representante de dados de mapeamento 3D reconstruídas das ilhotas. D: reconstrução 3D do quarto em fatias ilhota com base nas coordenadas obtidas pelo mapeamento das ilhotas. E: A análise matemática da composição celular e arquitetura. Left. Freqüência relativa de célula a célula, as distâncias entre as duas células em uma população única célula. Direita. Freqüência relativa de célula a célula, as distâncias entre as duas populações celulares diferentes. F: Kolmogorov-Smirnov (KS). Esquerda. Probabilidades cumulativas de célula a célula à distância para distribuições alfa-to-alfa, beta-de beta-e delta-to-delta células. Direita. KS distâncias para o correspondente três probabilidades cumulativas.
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Discussion
O assistida por computador visualização de grande escala e quantificação apresentada aqui pagar quatro pontos-chave em estudos de ilhotas pancreáticas: (1) A análise de larga escala de espécimes pancreático oferece uma visão abrangente da distribuição global de ilhotas tamanho e arquitetura da ilhota. (2) A reconstrução em 3D e análise matemática da composição celular e arquitetura facilitar ainda mais a análise do arranjo espacial de células endócrinas dentro de uma ilhota. (3) plasticidade ilhota Striking entre espécies diferentes e na mesma espécie em diferentes condições fisiopatológicas podem sugerir adaptação evolutiva adquirida em resposta a alterações metabólicas, em vez de diferenças entre as espécies. (4) Reorganização da composição endócrinas celular e arquitetura da ilhota, junto com mudanças na expressão gênica certas, pode refletir a adaptação ilhota em suas propriedades funcionais, o que sugere ainda a importância do papel da rede celular intraislet endócrino.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O estudo é apoiado por EUA Public Health Service Grant DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 para a Universidade de Chicago Diabetes Centro de Pesquisa e Treinamento (Core modelos animais), e um presente da Fundação Família Kovler.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | IX-81 | |
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus |
References
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