Summary
Nuevos métodos asistidos por ordenador a gran escala de adquisición y análisis de muestras de páncreas mediante inmunohistoquímica manchadas se describen: (1) Cortar la captura virtual de toda la sección, (2) análisis de la misa de datos a gran escala, (3) Reconstrucción de 2D cortes virtuales , (4) la cartografía en 3D de islotes, y (5) El análisis matemático.
Abstract
Los islotes pancreáticos es un único micro-órgano integrado por varias células secretoras de hormonas endocrinas, tales como las células beta (insulina), las células alfa (glucagón), y delta-células (somatostatina) que están incrustados en los tejidos exocrino y comprenden 1 - 2% de todo el páncreas. Hay una estrecha correlación entre el cuerpo y el peso del páncreas. Total de masa de células beta también aumenta en forma proporcional para compensar la demanda de insulina en el cuerpo. Lo que escapa a esta expansión es proporcional la distribución del tamaño de los islotes. Los animales grandes, como los seres humanos comparten similares distribuciones de tamaño de los islotes en ratones, lo que sugiere que este órgano micro-tiene un tamaño determinado para ser funcional. La incapacidad de los páncreas de animales grandes para generar islotes proporcionalmente más grande se ve compensada por un aumento en el número de islotes y por un aumento en la proporción de grandes islotes en su distribución global de tamaño islote. Además, los islotes muestran una plasticidad sorprendente en la composición celular y la arquitectura entre las diferentes especies y también dentro de la misma especie en diferentes condiciones fisiopatológicas. En el presente estudio, se describen nuevos enfoques para el análisis de los datos de la imagen biológica con el fin de facilitar la automatización de los procesos de análisis, que permiten el análisis de las colecciones de datos amplio y heterogéneo en el estudio de tales procesos dinámicos biológicos y estructuras complejas. Estos estudios se han visto obstaculizados por las dificultades técnicas de muestreo imparcial y la generación de grandes conjuntos de datos para capturar con precisión la complejidad de los procesos biológicos de la biología de los islotes. Aquí se muestran los métodos para recoger imparcial "representante" de datos dentro de la limitada disponibilidad de muestras (o reducir al mínimo la recogida de muestras) y los parámetros experimentales estándar, y analizar con precisión la compleja estructura tridimensional de la isleta. Asistida por ordenador permite la automatización de la recogida y análisis de grandes conjuntos de datos y también asegura interpretación imparcial de los datos. Además, la cuantificación precisa de la distribución de tamaño de los islotes y las coordenadas espaciales (es decir, X, Y, Z-posiciones) no sólo lleva a una visualización precisa de la estructura de los islotes pancreáticos y la composición, pero también nos permite identificar los patrones durante el desarrollo y la adaptación a las condiciones de alterar a través de modelos matemáticos. Los métodos desarrollados en este estudio son aplicables a los estudios de muchos otros sistemas y organismos también.
Protocol
1. La creación de cortes virtuales de inmunohistoquímica imágenes teñidas
- StereoInvestigator abierto. Coloque la lámina limpia la celebración de la muestra en el soporte de microscopio y visualizarla en el Investigador Stereo haciendo clic en "adquisición" y luego "Imagen en vivo" (Adquisición de imágenes en vivo →). Determinar los niveles de exposición para cada canal, en nuestro ejemplo concreto, el canal 2 se utiliza para DAPI, Canal 3 de la GFP, RFP para Channel 4, Channel 5 para Cy5, y el Canal 6 de Cy7. Utilice la opción "Histograma de vídeo" ventana, que muestra la intensidad de la fluorescencia, para determinar el nivel de exposición. Adecuada la intensidad de fluorescencia se alcanza cuando la intensidad de las colas en el extremo derecho del histograma de vídeo. Los niveles de exposición se puede cambiar en la "configuración de la cámara" de la ventana. El histograma de vídeo se puede enfocar con la rueda de enfoque del microscopio.
- Antes de crear un segmento virtual, el contorno de la muestra al hacer clic en la pantalla en un punto alejado de la muestra, que va a marcar un punto de referencia, a continuación, haga clic en el contorno de la muestra. Cuando el contorno esté completa, haga clic derecho y seleccionar "Cerrar contorno" para conectar los puntos de comienzo y fin.
- Una vez que el contorno está cerrado, la captura de un segmento virtual de la muestra (Adquisición → Adquirir Cortar Virtual). Cuando las opciones Cortar Virtual ventana abierta, seleccione "High Speed Adquirir", así como el enfoque automático, desmarcando la casilla junto a "Manual". Guarde el archivo.
- El corte virtuales pre-enfoque debe ser calibrado mediante la selección (clic derecho → Añadir a la lista de sitios de enfoque) y manual de enfoque varias secciones al azar, es decir, los sitios, en la vista previa rebanada virtual. Cuando varios sitios se han centrado, iniciar la rebanada Virtual (clic derecho → iniciar el segmento virtual con el enfoque previo). Después de la rebanada virtual de la muestra se completa la primera, cambiar al canal siguiente y ajustar la exposición en consecuencia. Repita los pasos 4 y 5 para cada canal.
2. Asistida por ordenador en dos dimensiones de análisis
La cuantificación de los islotes
- Las imágenes se procesan mediante una macro ImageJ llamado "IHCVS", que primero se prepara para el análisis de imágenes cargadas y cuantifica las características de los islotes, como la composición celular (es decir, cada área de la beta, alfa y delta-poblaciones de células, y los islotes zona en el valor de la suma). La pila se divide en sus canales diferentes y en ImageJ, donde cada canal se muestra una imagen por separado sobre la base de la tinción inmunohistoquímica. Cada imagen es automáticamente un umbral, después de que una imagen de 8 bits en blanco y negro, o una máscara, de la imagen de un umbral se produce. Las imágenes de canales separados se suman aritméticamente en una máscara compuesta, y construido en ImageJ es el análisis de partículas se lleva a cabo sobre la imagen compuesta.
- ROI luego son identificados, excluyendo las partículas más pequeñas que una sola de las células beta (<170 m 2, superficie que se calculará con un diámetro de unos 15 m; Hara et al, 2003).. El rendimiento de la inversión resultante se analizaron y cuantificaron utilizando ImageJ, la cuantificación puede incluir el perímetro (distancia alrededor de un área), la circularidad (un grado de redondez en el número 1.0 describe un círculo perfecto), el diámetro de Feret (la distancia más larga dentro de un área) y el centro las coordenadas de cada región analizada de manera que la distribución de los islotes pueden ser analizadas matemáticamente utilizando distintas combinaciones de estos parámetros y trazados en un gráfico 3D, los datos de que se utilizará para el modelado matemático. Una sola imagen rebanada virtual es analizada en 30 segundos. Varias imágenes pueden ser analizadas mediante la incorporación de la secuencia de comandos de procesamiento de imágenes y análisis en un bucle con el apoyo de la sintaxis de lenguaje de macros ImageJ. El circuito se abre todos los archivos en un directorio dado, analiza las imágenes, y los resultados los resultados en una nueva ubicación como un archivo de Excel.
- Los resultados agregados se guardan en una hoja de cálculo Excel, el almacenamiento de datos, tales como área, perímetro, circularidad, diámetro de Feret, y centro de los islotes de cada islote, junto con los números correspondientes marcados en la imagen.
Análisis computacional y configuración de histograma
- Scripts Mathematica, que se ejecutan automáticamente una vez iniciado, se utilizan para procesar los datos recogidos de hoja de cálculo, que asciende a cientos de miles de entradas. Uno de los procesos críticos que se ejecutan es un análisis de frecuencia, que construye un histograma para examinar la distribución del tamaño y también para determinar los valores atípicos en los datos. En el guión, el área total de los islotes se mide y se compara con otros parámetros, en particular a los puntos de tiempo o la edad del páncreas, y en consecuencia se muestra en un gráfico.
3. Reconstrucción tridimensional de las dos imágenes dimensionales Cortar inmunohistoquímica manchadas Virtual
La reconstrucción en 3D de cortes virtuales
- Copia de la escritura ("im_jp2_2_tiff") en el directorio (es decir, la carpeta) quecontiene las imágenes JP2. Ejecutar el script con el shell de Linux, escriba "./im_jp2_2_tiff" en la consola y luego pulsar enter. Ejecutar este script se convertirá automáticamente todas las imágenes JP2 en el directorio en archivos TIFF, que es el formato utilizado en la construcción y la cuantificación de las tres dimensiones de las pilas de los cortes virtuales. (Nota:. Escriba "chmod + x im_jp2_2_tiff" si el guión no funciona, lo que convertirá el archivo de texto en un script para que pueda funcionar correctamente)
- Cuando todas las imágenes capturadas se han convertido de JP2 en los archivos TIFF, que están listos para ser utilizados para el análisis de ImageJ.
- Con ImageJ, abrir todas las imágenes de la primera muestra (cinco imágenes en este caso: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) y los combina en una sola imagen (Image Color → → Combinar canales). Repita este proceso para cada una de las muestras. Cuando todas las muestras se han combinado en una sola imagen, limpiar las imágenes mediante la selección de regiones no deseadas con el "Selecciones Polígono" herramienta de relleno y en (Editar → Fill). (Cambiar el tamaño de las imágenes a un tamaño menor, si es necesario). A continuación, convertir cada imagen en una imagen en color RGB (Imagen → → Tipo de color RGB). Por último, crear una pila de las imágenes (imagen → → Pilas de imágenes de las pilas), después de lo cual aún se pueden alinear con la "Pila Reg" plug-in, si es necesario. En última instancia, la fusión de los canales y luego combinar las imágenes en 3D crea un montaje de todos los islotes en el páncreas. Para ver la imagen, haga clic en "Plugins" y luego "visor 3D."
4. Mapeo de los islotes
Recolección de Pilas de imágenes
- Situar a los islotes pancreáticos montar todo bajo el microscopio.
- Abra el software Slidebook. Acceder a la "Captura y Control de enfoque" presionando "Ctrl + Shift + E." En el "control de enfoque" de la ventana, fijó el objetivo de 20X o 40X, dependiendo del tamaño de la isleta. Aplique el agua si se utiliza una inmersión en agua lente del objetivo.
- Con el fin de utilizar el ocular del microscopio para localizar islotes, ajuste "Bin" de 2X y establecer el conjunto de filtros para Usuario1 en el "Control de enfoque" de la ventana. "Selección de emisión" se debe establecer en los ojos del 100% y de densidad neutra a 1. Haga clic en "buenas prácticas agrarias ey" y luego "Abrir Fluor".
- Para visualizar la muestra en Slidebook, volver a orientar los controles de la ventana y cambiar "Filtrar" para "en vivo" y haga clic en "buenas prácticas agrarias ds." Utilice el joystick para el centro de la isleta en la Cámara una ventana de la mejor manera posible. El foco a una profundidad de algún lugar cerca del centro de la isleta, donde las células se pueden discernir con facilidad.
- En el "foco de la ventana de controles", seleccione la pestaña "Z". Haga clic en situado en la esquina superior izquierda de la ventana para ajustar la profundidad actual como punto de referencia. Utilice el control alcance para desplazarse hasta la profundidad más alta del islote en el que las características se pueden distinguir con claridad y haga clic en "Set Top". Desplácese hasta la parte inferior de la isleta y haga clic en "Bottom Set." Haga clic en "Go" para volver al punto de referencia.
- En la ventana de captura, ajuste "Factor Bin" a "2X" y establecer "Filtrar" para "en vivo". Establecer el "tipo de captura" y "3D" (y sólo en 3D). En la parte derecha de la ventana, haga clic en "Usar posiciones superior e inferior." Haga clic en "Volver al punto de referencia después de la captura". Establecer el "Step Size" a "3".
- Debajo de la "Caja de conjuntos de filtros", seleccione DAPI ESD, las buenas prácticas agrarias ESD ESD PP, y Cy5 ESD. Para cada uno, haga clic en "encontrar el mejor" en "Ajuste de la exposición," y luego haga clic en "Test" para asegurarse de que la exposición seleccionada es la adecuada. Haga clic en "Inicio" para comenzar la captura.
- Cuando la captura se completa, ajustar los niveles como sea necesario y cambiar el color de muestra para la RFP en blanco. Guardar la diapositiva e ir a Ver → Exportar → TIFF serie. Escriba el nombre de la diapositiva con un guión al final y guardarlo. Decenas de cada uno de los archivos TIFF se crean, por lo que puede ser útil para mantener la pila de cada islote de la imagen en una carpeta separada.
Mapeo de Pilas de imágenes
- Abrir Investigador Stereo. Visualizar la imagen mediante la apertura de las pilas de la imagen (Archivo → → Pila Pila imagen Abrir imagen). En el "menú de la imagen de escala," set "distancia entre las imágenes" de 3,00 micras. Para corregir el binning 2X en Slidebook, seleccione "Reemplazar X y Escala Y" y "especificada por el usuario para la fuente de X y Y" Escala, y entre 0,65 para X e Y.
- Centro de la imagen haciendo clic en el centro de la isleta de interés en la "ventana de Macro". Marque al menos una célula con el marcador adecuado. Las células beta aparecerá en verde, las células alfa que aparecen de color rojo, y las células delta aparecen de color blanco, el uso de marcadores 2 (un círculo hueco) para marcar las células beta, marcador de 5 (un triángulo hueco) para marcar las células alfa, y el marcador de 6 ( un triángulo hueco) a las células delta. Las células deben estar marcados en el centro de su núcleo, que aparecen de color azul si la muestra ha sido teñidas con DAPI.
- Una vez que al menos una célula se ha caracterizado, mostrar la "Vista ortogonal" usando el icono en el menú superior. Marque "Z-Filter" y "simétrica". El rango de should se establece en 15,00. Comenzando por el nivel 0.0 Z, desplazarse por el islote utilizando la rueda del ratón y marcar cada celda con el marcador adecuado. Cada célula se debe marcar una sola vez en el centro de su profundidad. Al terminar marcando cada uno de los Z-niveles, el "Z-filter" casilla de verificación se puede desactivar. Esto le mostrará todos los marcadores de todos los niveles de Z-.
- Cuando cada célula se ha caracterizado, guarde el archivo como un "DAT" del archivo, y luego ir a Archivo → Exportar seguimiento. Guardar el trazado como un "txt". Haga clic en "nuevo archivo de datos" para borrar el espacio de trabajo antes de intentar asignar nuevos islotes.
5. Los resultados representativos:
La preparación de los cortes virtuales a partir de una muestra de páncreas mediante inmunohistoquímica manchadas permite examinar todas las células endocrinas (alfa, beta, delta y las células) en todo el páncreas, los dos juntos como islotes (Figura 1) e individualmente en canales separados ( Figura 1B). Con la ayuda de programas informáticos y los guiones, un análisis de la masa de datos a gran escala se pueden realizar en estos cortes virtuales. En concreto, un análisis de partículas de las máscaras compuestas (fig. 1C) se emite como una tabla de estadísticas que contienen parámetros tales como la zona de los islotes, el perímetro (la distancia alrededor de un área), la circularidad (un grado de redondez, donde 1.0 representa un círculo perfecto), y diámetro de Feret (la distancia más larga dentro de un área) de cada islote detectado (Figura 1D). El análisis a gran escala de estos resultados, las imágenes en la producción del número total de los islotes y los histogramas de distribución de tamaño, así como una comparación detallada de las partículas alfa y beta y delta de células áreas. Además, cada sector virtual se toma a una profundidad de aproximadamente 5 micras, y todos los individuales rebanadas virtuales en 2D son más apilarse para crear una reconstrucción en 3D de la muestra de páncreas entero. Mapeo islote muestra otro ejemplo no sólo de la captura de islotes en 3D, sino también de información detallada con ayuda de computadora de análisis. Asignación de los islotes consiste en la captura de los islotes distintos (Figura 2A) y la posterior marcado de alfa, beta y delta-células en varios Z-planos (Figura 2B) para visualizar un islote en 3D (Figura 2 C, D). El análisis automatizado de matemáticas de los islotes mapa muestra su composición celular y la arquitectura, incluyendo las distancias de la célula-célula (Figura 2 E) y las distribuciones de probabilidades acumuladas de distancia célula-célula (Figura 2F).
Figura 1. Gran escala de captura y análisis de la distribución de los islotes con rebanada virtual. A. Virtual vista rebanada de una sección de páncreas humanos. a. La tinción inmunohistoquímica para la insulina (verde), el glucagón (rojo), la somatostatina (blanco) y DAPI (azul). b. Construcción de 8-bit máscara después de umbralización automática. Un área de caja se magnifica en las vistas de BB de cada canal. a. delta-células, b. las células beta, c. las células alfa, y d. fusionó imagen compuesta. C. Análisis de partículas realizado en la máscara de compuestos. Tenga en cuenta que cada estructura de los islotes como grupos de células pequeñas es numerada (resaltado en azul). Estadísticas D. tabla de diversos parámetros medidos para estructuras individuales, que tienen identificadores que corresponden a las etiquetas se muestra en la C.
Figura 2. Análisis de Slice Virtual inmunohistoquímica. A. gráfico de dispersión 3D de la figura 1 muestra la distribución de tamaño y forma de cada uno de los islotes de parámetros como la superficie, la circularidad y el diámetro de Feret. B. gráfico de dispersión 3D de la figura 1 muestra la composición de los islotes celulares y el tamaño. C. La distribución de tamaño de los islotes del análisis de la sección humana de la figura 1 equipada con una distribución de densidad de probabilidad lognormal. D. Análisis Matemático de las relaciones composición celular (células beta en color verde, las células alfa y delta en rojo las células en azul) para cada intervalo de diámetro islote efectiva de la figura 1. E. a. Islote de distribución de tamaño de los análisis de muestras al azar de inmunohistoquímica (izquierda). Islote de distribución de tamaño de análisis rebanada virtual (derecha). b. Log-normal de comparación gráfica de análisis de un muestreo aleatorio de inmunohistoquímica (rojo) y el tramo virtual (azul).
Figura 3. Islet la cartografía y el análisis matemático de la composición celular y la arquitectura. A: captura de pantalla que muestra un plano focal simple de una pila 3D de las imágenes reconstruidas de un islote humano cargado en estéreo-investigador (las células beta en color verde, las células alfa en rojo, el delta-células en blanco, y los núcleos en azul) . B: las imágenes de fluorescencia (izquierda) y los correspondientes datos cartográficos (derecha) en tres planos focales diferentes se muestra en un intervalo de 10 micras. C: visión representativa de datos 3D reconstruido islote de mapeo. D: La reconstrucción en 3D de los cuartos de rodajas de islotes sobre la base de las coordenadas obtenidas mediante la asignación de los islotes. E: El análisis matemático de la composición celular y la arquitectura. LEFT. Frecuencia relativa de las distancias de célula a célula entre dos células en una población de células individuales. Derecha. Frecuencia relativa de las distancias de célula a célula entre dos poblaciones diferentes de células. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) de prueba. Izquierda. Probabilidades acumuladas de la célula a célula de distribución de la distancia para el alfa-a-alfa, beta-beta-a, y las células delta a delta. Derecha. KS distancias de los correspondientes tres probabilidades acumuladas.
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Discussion
El asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación que aquí se presenta pagar cuatro puntos clave en los estudios de los islotes pancreáticos: (1) Un análisis a gran escala de muestras de páncreas proporciona una visión completa de la distribución del tamaño total del islote y la arquitectura del islote. (2) La reconstrucción en 3D y el análisis matemático de la composición celular y la arquitectura de facilitar aún más el examen de la disposición espacial de las células endocrinas en un islote. (3) Lograr la plasticidad islote entre las diferentes especies y en la misma especie bajo diferentes condiciones fisiopatológicas puede sugerir la adaptación evolutivamente adquirida en respuesta a los cambios metabólicos, en lugar de las diferencias entre especies. (4) Reordenamiento de la composición celular endocrino y la arquitectura del islote, junto con los cambios en la expresión de ciertos genes, puede reflejar la adaptación de los islotes en sus propiedades funcionales, lo que sugiere, además, la importancia del papel de la red intraislet células endocrinas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El estudio está respaldado por EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvención DK-081527, 072473-DK y DK-20595 de la Universidad de Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal principales modelos), y un regalo de la Fundación de la Familia Kovler.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | IX-81 | |
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus |
References
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- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. Islet architecture - a comparative study. ISLETS. 1, 129-136 (2009).
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