Компьютерный Крупномасштабные визуализации и количественной оценки островков поджелудочной железы Масса, распределении размеров и архитектуры

Summary

Роман компьютерных методов крупномасштабных закупок и анализ иммуногистохимии окрашенных препаратов поджелудочной железы, описаны: (1) Виртуальные захвата Кусочек целый раздел, (2) Массовый анализ крупномасштабных данных, (3) Реконструкция 2D Виртуальный Ломтики ; (4) 3D островок картирование; и (5) Математический анализ.

Abstract

Островков поджелудочной железы является уникальным микро-орган, состоящий из нескольких гормонов секретирующие эндокринные клетки, такие как бета-клеток (инсулин), альфа-клетки (глюкагон) и дельта-клеток (соматостатин), внедренные в экзокринной ткани и составляют 1 - 2% от всей поджелудочной железы. Существует тесная связь между телом и поджелудочная железа весом. Всего бета-клеточной массы пропорционально увеличивается для компенсации спрос на инсулин в организме. Что это побег пропорциональное расширение распределение по размерам островков. Крупные животные, такие как люди разделяют подобный островок размером распределений с мышами, предполагая, что это микро-орган имеет определенные ограничения на размер, чтобы быть функциональным. Неспособность большого pancreata животных для создания пропорционально большее островков компенсируется за счет увеличения числа островков и увеличение доли больших островков в их общем размер дистрибутива островок. Кроме того, островки выставку поразительной пластичности в клеточный состав и архитектуры различных видов, а также в пределах одного вида в различных патофизиологических условиях. В настоящем исследовании мы описываем новые подходы для анализа биологических данных изображения с целью облегчения автоматизации аналитических процессов, которые позволяют анализа больших и разнородных коллекций данных в исследовании таких динамических биологических процессов и сложных структур. Такие исследования были затруднены из-за технических трудностей объективного отбора и создания крупномасштабных наборов данных для точного захвата сложности биологических процессов островок биологии. Здесь мы показываем, методов сбора беспристрастной "представитель" данных в пределах ограниченного наличия образцов (или свести к минимуму проб) и стандартных экспериментальных условиях, и точно анализировать сложные трехмерные структуры островок. Компьютерный автоматизации позволяет осуществлять сбор и анализ крупных наборов данных, а также обеспечивает объективное освещение данных. Кроме того, точная количественная оценка островок размер дистрибутива и пространственных координат (например, X, Y, Z-позиции) не только приводит к точной визуализации поджелудочной структуры островок и композиции, но и позволяет выявить закономерности в процессе разработки и адаптации к изменению условий путем математического моделирования. Методы, разработанные в ходе данного исследования применимы к исследованию многих других систем и организмов, а также.

Protocol

1. Создание виртуальных Ломтики иммуногистохимическое Витражи Изображения

1. Открытое StereoInvestigator. Место проведения чистый слайд образца в микроскоп держателя и визуализировать его в стерео следователь нажав на кнопку "Приобретение", а затем "Live Image" (Приобретение → живого изображения). Определить уровни воздействия для каждого канала, в нашем конкретном примере, канал 2 используется для DAPI, канал 3 для GFP, Channel 4 для ППП, 5 канал для Cy5, и канал 6 для Cy7. Используйте "Видео Гистограмма" окно, которое отображает интенсивность флуоресценции, чтобы определить уровень экспозиции. Соответствующие интенсивности флуоресценции достигается при интенсивности хвостов на правом конце видео гистограммы. Уровни воздействия может быть изменено в "Настройки камеры" окна. Видео Гистограмма может быть сфокусирован с колес фокус микроскопа.
2. Перед созданием виртуального фрагмент, контур образца, нажав на экран в точку от образца, который станет точкой отсчета, а затем щелкнув по контуру образца. Когда контур завершена, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Закрыть контур" для подключения начале и в конце.
3. Как только контур закрыт, захвата виртуальных фрагментов для образца (приобретение → приобретать виртуальные Slice). Когда виртуальная фрагмент окне настроек открыто, выберите "High Speed ​​приобретать", а также автоматической фокусировки, сняв флажок рядом с "Ручная". Сохраните файл.
4. Виртуальная часть предварительной фокусировки должен быть откалиброван, выбрав (правой кнопкой мыши → Добавить в фокусе Список узлов) и вручную фокусировки несколько случайных сечений, то есть сайты, в виртуальной предварительного просмотра фрагмента. Когда несколько сайтов были сосредоточены, запустить виртуального фрагмента (правой кнопкой мыши → Запустить виртуальную фрагмент с предварительной фокусировки). После виртуального фрагмент для первого образца завершена, переключиться на следующий канал и настроить экспозицию соответственно. Повторите шаги 4 и 5 для каждого канала.

2. Компьютерный двумерного анализа

Количественная оценка Островки

1. Изображения затем обрабатываются с помощью макросов ImageJ названием "IHCVS", который впервые готовится загруженных изображений для анализа и затем количественно особенности островки, такие как клеточный состав (то есть в каждой области бета-, альфа-и дельта-клеточной популяции, и островок области на сумму стоимости). Стек разделен на отдельные каналы в ImageJ, где каждый отдельный канал показывает отдельные изображения на основе иммуногистохимического окрашивания. Каждое изображение автоматически thresholded, после чего 8-битные черно-белое изображение, или маской, из thresholded изображение. Отдельные изображения канала, затем суммируются арифметически в композитных маску, и встроенный частиц ImageJ на анализ проводится на составное изображение.
2. Трансформирования затем определили исключая при этом частиц размером менее одной единственной клетки бета (<170 мкм ^2, площадь рассчитывается диаметром ~ 15 мкм, Хара и др., 2003.). Результирующая трансформирования анализируются и количественно, используя ImageJ; количественное может включать в себя периметра (расстояние окружающих область), округлости (степень округлости, где число 1,0 изображает идеальный круг), диаметр Фере (в длинную дистанцию ​​в пределах области) и в центре координаты для каждой анализируемой области, так что островок распределения может быть математически проанализированы с помощью различных сочетаний этих параметров и построена в 3D-графике, данные которого будут использованы для математического моделирования. Единый виртуальный образ срез проанализированы в 30 секунд. Множественные изображения могут быть проанализированы путем встраивания обработки и анализа изображений скрипт в цикле синтаксис поддерживается язык ImageJ макроса. Цикл открывает все файлы в заданной директории, анализирует изображение и выводит результаты в новое место файла Excel.
3. Агрегированные результаты сохраняются в таблицу Excel, хранения данных, таких как площадь, периметр, округлости, диаметр Фере, и островок центра для каждого островка, вместе с соответствующими номерами помечены на изображении.

Вычислительная Анализ и гистограммы установки

1. Mathematica скрипты, которые выполняются автоматически, как только началась, используемые для обработки таблиц данных, собранных в размере сотен тысяч записей. Одним из важных процессов, которые запускаются в частотный анализ, который строит гистограммы используются для изучения распределения по размерам, а также для определения выбросов в данных. По сценарию, общая площадь островка измеряется и по сравнению с другими параметрами, в частности, временных точек или возраст поджелудочной железы, а затем соответственно отображаются в виде графика.

3. Трехмерная реконструкция двумерных иммуногистохимическое Витражи виртуальных образов фрагментов

3D-реконструкция Виртуальный Ломтики

1. Скопируйте сценарий ("im_jp2_2_tiff") в каталог (например, папки), чтосодержит jp2 изображений. Запустите скрипт с оболочкой Linux, набрав "./im_jp2_2_tiff" в консоли и нажмите клавишу ВВОД. Запуск этого сценария будет автоматически преобразовывать все jp2 изображений в каталоге в файлы TIFF, который формат, используемый в строительстве и количественной оценки трехмерных стеков из виртуального Slices. (Примечание:. Введите "CHMOD + х im_jp2_2_tiff", если скрипт не запускается, который будет конвертировать текстовый файл в сценарий так, что она может работать должным образом)
2. Когда все отснятые изображения были преобразованы из jp2 в TIFF файлы, они готовы быть использованы для анализа в ImageJ.
3. С ImageJ, открыть все изображения для первого образца (пять изображений в данном случае: DAPI, GFP, ППП, Cy5, Cy7) и объединить их в одно изображение (Image → Цвет → Объединить каналы). Повторите эту процедуру для каждого из образцов. Когда все образцы были объединены в одно изображение, чистые изображения, выбрав нежелательных регионов с "Полигон Выбор" Инструмент и заполняя их (Edit → Fill). (Изменение размера изображения меньшего размера, если это необходимо). Потом конвертировать все изображения в изображение RGB цвета (Image → Тип → RGB цвет). И наконец, создать стек из изображений (Image → Стеки → Изображение в стеки), после чего они могут еще быть согласована с "Стек Reg" плагин, если это необходимо. В конечном счете, объединение каналов и затем комбинируя изображения создает 3D монтаж всех островков во всей поджелудочной железы. Для просмотра изображения, нажмите на кнопку "Плагины" и затем "3D-просмотра."

4. Островок карты

Сбор изображения Стеки

1. Размещайте целом островков поджелудочной крепление под микроскопом.
2. Открытое программное обеспечение Slidebook. Доступ "Захват и фокус управления", нажав "Ctrl + Shift + E." В "Focus Control" окна, установить цель 20X или 40X, в зависимости от размера островка. Применение воды при использовании цель погружения в воду линзы.
3. Для того чтобы использовать микроскоп окуляром, чтобы найти островки, установите "бен" в 2 раза и установить фильтр Установите User1 в "Фокус управления" окна. "Выброс Выбор" должен быть установлен на 100% Глаза и нейтральной плотности в 1. Нажмите кнопку "GFP еу" и откройте "Fluor".
4. Для визуализации образца в Slidebook, возвращение в фокус управления окном и переключатель "Установить фильтр" на "Live" и нажмите кнопку "GFP DS." С помощью джойстика центре островок в камеру 1 окно, а также возможно. Фокус на глубину где-то недалеко от центра островка, где клетки можно различить легко.
5. В "Окно Фокус управления", выберите "Z вкладке". Нажмите установлен в верхнем левом углу окна для установки текущей глубины в качестве точки отсчета. Используйте возможности управления, чтобы перейти к верхней глубину островок в какие функции может быть выявлен и нажмите кнопку "Set Top". Выделите нижнюю часть островка и нажмите кнопку "Установить Bottom." Нажмите кнопку "Go", чтобы вернуться к исходной точке.
6. В Захват окна, установить "бен Фактор" до "2X" и установить "Установить фильтр" на "Live". Установить "Захват типа" в "3D" (и только 3D). На правой стороне окна, нажмите кнопку "Использовать сверху и снизу позиции". Нажмите кнопку "Вернуться в Точка отсчета После захвата". Установить "Step Size" до "3".
7. Под "Фильтр Box Set", выберите DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU, и Cy5 DSU. Для каждого из них, нажмите "Найти Best" в разделе "Коррекция экспозиции", затем нажмите кнопку "Тест", чтобы убедиться, что выбранная экспозиция подходит. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать захват.
8. При захвате завершено, настраивать уровни по мере необходимости и изменения отображаемого цвета для RFP на белый. Сохранить слайд и выберите Вид → Экспорт → TIFF серии. Введите имя слайд с тире в конце, и сохраните его. Десятки отдельные файлы TIFF создаются, так что может быть полезно сохранить изображение стек каждого островка в отдельную папку.

Изображение карты Стеки

1. Открытый Stereo следователь. Визуализируйте изображение, открыв изображение стеки (Файл → Изображение Стек → Картинка стек Open). В "меню масштабирование изображения," набор "Расстояние между изображениями" до 3,00 мкм. Для коррекции 2X биннинга в Slidebook, выберите "Перекрыть X и Y Масштабирование" и "пользователя, который указан на источник X и Y" Масштабирование и введите 0,65 как для X и Y.
2. Центр изображения, нажав кнопку в центре островок интерес к "Макро окно". Марка по крайней мере одну ячейку с помощью соответствующий маркер. Бета-клетки появится зеленый, альфа-клетки появляются красные, и дельта-клетки появляются белые, использование маркеров 2 (полый круг), чтобы отметить бета-клеток, маркер 5 (полый треугольник), чтобы отметить альфа-клетки, и маркер 6 ( полый треугольник), дельта клетки. Клетки должны быть отмечены в центре их ядра, который появится синий, если образец был окрашивали DAPI.
3. Как только хотя бы одна ячейка была отмечена, показ "Ортогональные Вид", используя иконку в верхнем меню. Проверьте "Z-фильтр" и "Симметричный". Диапазона сhould быть установлен в 15.00. Начиная с уровня 0,0 Z, прокрутите островок с помощью колеса мыши и отметьте каждую ячейку с соответствующим маркером. Каждая ячейка должна быть отмечена только один раз в центре его глубины. По окончании маркировки каждого из Z-уровней, "Z-фильтр" флажок может быть снят. Это покажет все маркеры из всех Z-уровнях.
4. При каждой клетке было отмечено, сохраните файл как "DAT" файл, а затем перейдите в меню Файл → Экспорт Tracing. Сохранить трассировки как "TXT" файл. Нажмите кнопку "Создать файл данных", чтобы очистить рабочее пространство перед тем, как карта новых островков.

5. Представитель Результаты:

Подготовка виртуальной фрагменты из иммуногистохимическое окрашенных поджелудочной железы образца позволяет изучить все эндокринные клетки (альфа-, бета-и дельта-клеток) в целом поджелудочной железы, как вместе, как островки (рис. 1А) и индивидуально в отдельных каналах ( Рис 1В). С помощью компьютерных программ и скриптов, массовый анализ крупномасштабных данных может быть выполнена на эти виртуальные фрагменты. В частности, анализа частиц составных маски (рис. 1C) выводится в виде таблицы, содержащей статистику таких параметров, как островок площадь, периметр (расстояние окружающих область), округлости (степень округлости, где 1,0 представляет собой идеальный круг), и Диаметр Фере (в длинную дистанцию ​​в пределах области) за каждый островок обнаружено (рис. 1D). Масштабного анализа этих образов приводит к производству от общего числа островок и гистограммы распределения по размерам, а также подробное сравнение альфа-, бета-и дельта-диапазонов ячеек. Кроме того, каждая виртуальная фрагмент принимается на глубине около 5 мкм, и все отдельные фрагменты 2D Виртуальный далее сложены для создания 3D-реконструкция всей выборке поджелудочной железы. Островок отображение демонстрирует еще один пример не только захват островка в 3D, но и детального компьютерного анализа. Островок отображение состоит из захвата отдельных островков (рис. 2А) и последующей маркировки альфа-, бета-и дельта-клетки на различных Z-плоскости (рис. 2Б) для визуализации островок в 3D (рис. 2в, г). Автоматизированная математического анализа отображаются островков показывает их клеточный состав и архитектуры, в том числе межклеточного расстояния (рис. 2E) и кумулятивные вероятности межклеточного расстояния распределения (рис. 2F).

Рисунок 1. Крупномасштабные сбор и анализ распределения островков с помощью виртуального фрагмент. А. Виртуальный срез зрения человека разделе поджелудочной железы. a. Иммуногистохимическое окрашивание на инсулин (зеленый), глюкагон (красный), соматостатин (белый) и DAPI (синий). b. Старинная 8-битной маски после автоматического выделения. Коробках площадь увеличивается в BB Просмотров каждого канала. a. дельта-клетки, b. бета-клетки, c. альфа-клетки, и d. объединены совмещенное изображение. C. частиц анализ, проведенный на композитный маску. Заметим, что каждый островок структуры в том числе малых кластеров ячейки пронумерованы (голубой подсветкой). D. Статистика таблицу различных измеряемых параметров для отдельных структур, которые имеют идентификаторы, соответствующие теги показано на C.

Рисунок 2. Анализ Иммуногистохимическое Виртуальный фрагмент. А. 3D точечный график на рисунке 1 показаны размеры и форма распределения каждого островка такими параметрами, как площадь, округлости и диаметра FERET в. Б. 3D точечный график на рисунке 1 показаны клеточного состава островков и размера. С. Островок распределение по размерам всей человеческой анализа раздел из рисунка 1, установленная на логнормальное распределение плотности вероятности. Д. Математический анализ клеточного состава соотношения (бета-клеток в зеленый, альфа-клеток в красном и дельта-клетки в синий) для каждого островка эффективной бен диаметр рисунке 1. Е. А. Островок размер распределения случайной выборки иммуногистохимического анализа (слева). Островок распределение по размерам виртуальных анализ ломтик (справа). b. Вход для нормального сравнения участок случайной выборки иммуногистохимического анализа (красный) и виртуальных ломтик (синий).

Рисунок 3. Островок картирования и математический анализ клеточного состава и архитектуры. : Экран захвата показывает одну фокальной плоскости от 3D реконструированы стек изображений человеческих островок загружены в стерео-следователь (бета-клеток в зеленый, альфа-клеток в красном, дельта-клетки в белом, и ядер в синий) . B: флуоресцентные изображения (слева) и соответствующий отображаются данные (справа) в трех различных фокальных плоскостях показаны с интервалом в 10 мкм. C: Представитель зрения 3D реконструированы отображения данных островок. D: 3D-реконструкция квартала нарезанный островок на основе координат получены островок отображения. E: Математический анализ клеточного состава и архитектуры. LEFT. Относительная частота межклеточного расстояния между двумя ячейками в одной популяции клеток. Верно. Относительная частота межклеточного расстояния между двумя различными популяциями клеток. F: Колмогорова-Смирнова (KS) тест. Левых. Накопительное вероятности клетка-клетка расстояние распределения альфа-к-альфа-, бета-к-бета и дельта-на-дельта клетки. Верно. К. С. расстояния для соответствующих трех кумулятивных вероятностей.

Discussion

Компьютерной крупномасштабных визуализации и количественной оценки, представленные здесь позволить себе четыре ключевых точек в исследованиях островков поджелудочной железы: (1) крупномасштабные анализ образцов поджелудочной железы дает полное представление о общее распределение размеров островков и островков архитектуры. (2) 3D-реконструкции и математический анализ клеточного состава и архитектуры дальнейшего облегчения изучения пространственного расположения эндокринных клеток в островок. (3) Поразительные пластичности островок среди различных видов и того же вида в различных патофизиологических условиях может предложить эволюционно приобретенные адаптации в ответ на метаболические изменения, а не видовые различия. (4) Перестройка эндокринной клеточный состав и островок архитектуры, наряду с изменениями в определенных экспрессии генов, возможно, отражает островок адаптации в его функциональные свойства, которые также предлагает значение роли сотовой сети эндокринной intraislet.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook		Program	Olympus