Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

Summary

Metodi computer-assistita romanzo di grandi appalti e l'analisi di campioni di pancreas immunoistochimiche colorati sono descritte: (1) l'acquisizione di Virtual Fetta di tutta la sezione, (2) analisi di massa di dati su larga scala, (3) Ricostruzione di sezioni 2D virtuale , (4) la mappatura delle isole 3D, e (5) Analisi Matematica.

Abstract

Le isole pancreatiche è un unico micro-organo composto da cellule endocrine che secernono diversi ormoni come il beta-cellule (insulina), alfa-cellule (glucagone) e delta-cellule (somatostatina) che sono incorporati nel tessuto esocrino e comprendono 1 - 2% del pancreas intero. Vi è una stretta correlazione tra il corpo e il peso del pancreas. Totale delle cellule beta massa aumenta proporzionalmente anche per compensare la richiesta di insulina nel corpo. Ciò che sfugge a questa espansione proporzionale è la distribuzione delle dimensioni delle isole. Grandi animali come gli esseri umani condividono simili distribuzioni isolotto formato con i topi, suggerendo che questo micro-organo ha un certo limite dimensioni per essere funzionale. L'incapacità del pancreas grande animale per generare isolotti proporzionalmente maggiore è compensata da un aumento del numero di isolotti e da un aumento della proporzione di più grandi isole nella loro distribuzione complessiva dimensioni isolotto. Inoltre, isolotti mostrano una plasticità impressionante nella composizione cellulare e architettura tra le diverse specie e anche all'interno della stessa specie in diverse condizioni fisiopatologiche. Nel presente studio, si descrivono nuovi approcci per l'analisi dei dati di immagine biologici al fine di facilitare l'automazione dei processi analitici, che permettono l'analisi di grandi raccolte di dati eterogenei e nello studio di tali processi dinamici biologici e strutture complesse. Tali studi sono stati ostacolati a causa di difficoltà tecniche di campionamento imparziale e generando grandi insiemi di dati da catturare con precisione la complessità dei processi biologici di biologia isolotto. Qui si mostrano i metodi per raccogliere imparziale "rappresentante" dei dati all'interno della limitata disponibilità di campioni (o ridurre al minimo la raccolta del campione) e le impostazioni standard sperimentali, e di analizzare con precisione la complessa struttura tridimensionale dell'isolotto. Assistita da computer di automazione consente la raccolta e l'analisi di grandi set di dati e assicura anche imparziali di interpretazione dei dati. Inoltre, la quantificazione precisa della distribuzione delle dimensioni delle isole e coordinate spaziali (ad esempio X, Y, Z-posizioni) non solo porta ad una visualizzazione accurata della struttura di isole pancreatiche e la composizione, ma ci permette anche di identificare i modelli durante lo sviluppo e l'adattamento alle condizioni di alterazione attraverso modelli matematici. I metodi sviluppati in questo studio sono applicabili gli studi di molti altri sistemi e organismi pure.

Protocol

1. Creazione di slice virtuali di immunoistochimiche Immagini Stained

1. StereoInvestigator aperto. Posizionare il vetrino pulito tenendo il campione nel supporto microscopio e visualizzare in Investigator Stereo cliccando su "acquisizione" e poi "Live Image" (Acquisizione → Foto Live). Determinare livelli di esposizione per ogni canale, nel nostro esempio specifico, il canale 2 è utilizzato per DAPI, Canale 3 per GFP, Channel 4 per RFP, Canale 5 per Cy5, e Canale 6 per Cy7. Utilizzare il "Istogramma Video" finestra, che visualizza l'intensità della fluorescenza, per determinare il livello di esposizione. Appropriata intensità di fluorescenza è raggiunto quando le code di intensità fino alla fine a destra del video istogramma. Livelli di esposizione possono essere modificate nella finestra "Impostazioni fotocamera". L'istogramma video può essere messo a fuoco con la ruota fuoco microscopio.
2. Prima di creare una fetta virtuale, contorno l'esempio facendo clic sullo schermo in un punto lontano dal campione, che segnerà un punto di riferimento, e quindi facendo clic su tutto il contorno del campione. Quando il profilo è completo, fare clic destro e selezionare "Contorno Chiudi" per collegare i punti d'inizio e fine.
3. Una volta che il contorno è chiuso, catturare una fetta virtuale per il campione (→ Acquisizione Acquisire fetta virtuale). Quando la finestra di Virtual opzioni Slice aperta, selezionare "High Speed ​​Acquisisci" così come messa a fuoco automatica deselezionando la casella accanto a "Manuale". Salvare il file.
4. La fetta virtuale messa a fuoco preliminare deve essere calibrato, selezionando (tasto destro → Aggiungi a fuoco Site List) e di messa a fuoco manuale diverse sezioni a caso, cioè, i siti, in anteprima Slice virtuale. Quando vari siti sono stati concentrati, avviare il Slice virtuale (tasto destro → Avvia fetta virtuale con messa a fuoco preliminare). Dopo la fetta virtuale per il primo campione è completa, passare al canale successivo e regolare l'esposizione di conseguenza. Ripetere i passaggi 4 e 5 per ogni canale.

2. Computer-assistita analisi bidimensionale

Quantificazione degli isolotti

1. Le immagini vengono poi elaborati utilizzando una macro ImageJ denominata "IHCVS", che si prepara prima le immagini caricate per l'analisi e poi quantifica le caratteristiche di isolotti come la composizione cellulare (cioè ogni area di beta-, alfa-e delta-popolazioni di cellule, e isolotto zona al valore somma). Lo stack viene divisa nei canali separati in ImageJ, dove ogni singolo canale mostra una immagine separata in base alla colorazione immunoistochimica. Ogni immagine viene poi automaticamente thresholded, dopo di che l'immagine a 8-bit in bianco e nero, o una maschera, l'immagine thresholded viene prodotta. Le immagini dei canali separati vengono poi sommati aritmeticamente in una maschera composito e ImageJ incorporato nella analisi di particelle viene eseguita l'immagine composita.
2. ROI sono poi identificate escludendo particelle più piccole di una cellula beta singola (<170 micron ^2; area calcolata con un diametro di circa 15 micron; Hara et al, 2003).. Il ROI risultante vengono analizzati e quantificati con ImageJ; quantificazione possono includere perimetrale (una distanza che circonda una zona), la circolarità (un grado di rotondità, dove il numero 1,0 raffigura un cerchio perfetto), diametro Feret (la distanza più lunga in uno spazio) e il centro coordinate per ogni regione analizzata in modo che la distribuzione isolotto può essere matematicamente analizzati utilizzando varie combinazioni di questi parametri e tracciati in un grafico 3D, i cui dati saranno utilizzati per la modellazione matematica. Una singola immagine fetta virtuale viene analizzato in 30 secondi. Immagini multiple possono essere analizzati inserendo la elaborazione delle immagini e script di analisi in una sintassi supportata da ImageJ linguaggio macro. Il ciclo si apre tutti i file in una determinata directory, analizza le immagini, e le uscite dei risultati in una nuova posizione come un file di Excel.
3. I risultati aggregati vengono salvati in un foglio Excel, la memorizzazione di dati quali area, perimetro, circolarità, diametro Feret, e per ogni centro isolotto isolotto, insieme con i numeri corrispondenti etichettati nell'immagine.

Analisi computazionale e l'installazione Istogramma

1. Gli script di Mathematica, che avvia automaticamente una volta avviato, vengono utilizzate per elaborare i dati raccolti foglio di calcolo, pari a centinaia di migliaia di voci. Uno dei processi critici che vengono eseguiti è una analisi in frequenza, che costruisce un istogramma utilizzato per esaminare la distribuzione dimensioni e anche a determinare valori anomali nei dati. Sotto la scritta, zona isolotto totale viene misurato e confrontato con altri parametri, in particolare per i punti di tempo o l'età del pancreas, e poi di conseguenza visualizzate in un grafico.

3. Ricostruzione tridimensionale di immagini bidimensionali immunoistochimiche Stained fetta virtuale

Ricostruzione 3D di sezioni virtuali

1. Copiare lo script ("im_jp2_2_tiff") nella directory (ad esempio, cartella) checontiene le immagini JP2. Eseguire lo script con la shell di Linux digitando "./im_jp2_2_tiff" nella console e quindi premere INVIO. Esecuzione di questo script convertirà automaticamente tutte le immagini JP2 nella directory in file tiff, che è il formato utilizzato per la costruzione e la quantificazione delle tridimensionale stack dal Fette virtuale. (Nota:. Digitare "chmod + x im_jp2_2_tiff" se lo script non viene eseguito, che convertirà il file di testo in uno script in modo che possa funzionare correttamente)
2. Quando tutte le immagini catturate sono stati convertiti dal JP2 in file tiff, sono pronti per essere utilizzati per l'analisi in ImageJ.
3. Con ImageJ, aprire tutte le immagini per il primo campione (cinque immagini in questo caso: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) e unirle come un'unica immagine (Immagine → Colore → Unisci canali). Ripetere la procedura per ognuno dei campioni. Quando tutti i campioni sono stati combinati come immagini singole, pulire le immagini selezionando regioni indesiderati con il "Poligono Selezioni" strumento e riempimento in (Modifica → Riempi). (Ridimensionare le immagini a una dimensione inferiore, se necessario). Poi convertire ogni immagine in un immagine a colori RGB (Immagine → Tipo → colore RGB). Infine, creare uno stack di immagini (Image Stack → Immagine → per Stack), dopo di che può ulteriormente essere allineato con il "Stack Reg" plugin, se necessario. In definitiva, la fusione dei canali e poi combinando le immagini 3D crea un montaggio di tutte le isole del pancreas intero. Per visualizzare l'immagine, clicca su "Plugin" e poi "visualizzatore 3D."

4. Isolotto Mapping

Raccolta pile Immagine

1. Situare l'intera isole pancreatiche montare sotto il microscopio.
2. Aprire il software Slidebook. Accedere alla "Cattura e Focus di controllo" premendo il tasto "Ctrl + Maiusc + E." In "Control Focus" finestra, ha fissato l'obiettivo a 20X o 40X, a seconda delle dimensioni dell'isolotto. Applicare acqua se si utilizza una immersione in acqua lente obiettiva.
3. Per poter utilizzare l'oculare microscopio per individuare isolotti, impostare "Bin" a 2X e impostare il set di filtri per Utente1 nella finestra "Controlli Focus". "Selezione delle emissioni" dovrebbe essere impostato su 100% Occhi e densità neutra a 1. Fare clic su "GFP ey" e poi "Apri Fluor".
4. Per visualizzare il campione in Slidebook, tornare alla finestra e concentrare i controlli switch "Imposta filtro" a "Live" e clicca su "GFP ds". Utilizzare il joystick per centrare l'isolotto nella finestra telecamera 1 nel miglior modo possibile. Messa a fuoco ad una profondità da qualche parte vicino al centro dell'isolotto, dove le cellule si possono individuare facilmente.
5. Nella "Finestra concentrare i controlli", selezionare la scheda "Z". Fare clic su Imposta nell'angolo in alto a sinistra della finestra per impostare la profondità attuale come punto di riferimento. Utilizzare il controllo portata per scorrere fino alla profondità superiore dell'isolotto in cui caratteristiche possono essere individuate in modo chiaro e cliccare su "Set Top". Scorrere fino alla fine dell'isolotto e cliccare su "Imposta basso". Fare clic su "Go" per tornare al punto di riferimento.
6. Nella finestra di acquisizione, impostare "Bin Factor" a "2X" e impostate "Imposta filtro" a "Live". Impostare il "Tipo di cattura" a "3D" (e solo 3D). Sul lato destro della finestra, fare clic su "Utilizza posizioni superiore e inferiore." Fare clic su "Torna al punto di riferimento dopo la cattura." Impostare "Step Size" a "3".
7. Sotto il "Box Set Filter", selezionare DAPI DSU, DSU GFP, RFP DSU, e Cy5 Dsu. Per ciascuno di essi, fare clic su "Trova le migliori" sotto "Regola esposizione", quindi fare clic su "Test" per assicurarsi che l'esposizione scelto è adatto. Fare clic su "Start" per iniziare la cattura.
8. Quando la cattura è completa, regolare i livelli e, se necessario modificare il colore visualizzato per RFP al bianco. Salvare la diapositiva e passare alla visualizzazione → Esporta → TIFF serie. Digitare il nome della diapositiva con un trattino alla fine e salvarlo. Decine di singoli file TIFF vengono creati, quindi potrebbe essere utile per mantenere serie di immagini di ogni isolotto in una cartella separata.

Mappatura Stack Immagine

1. Aprire Investigator stereo. Visualizzare l'immagine aprendo le pile immagine (File → Pila → Pila immagine Apri immagine). Nel "menu Immagine Scala", "Distanza tra immagini" impostato a 3,00 micron. Per correggere in binning 2X Slidebook, selezionare "Sostituisci X e Y Scala" e "Utente specificato di Fonte di X e Y" Scaling, e inserire 0,65 per X e Y.
2. Centrare l'immagine facendo clic in mezzo l'isolotto di interesse per la "finestra della macro". Segna almeno una cella utilizzando il marker appropriati. Beta-cellule apparirà verde, le cellule alfa apparirà rosso, e le cellule delta appare bianco; Marker utilizzare 2 (un cerchio vuoto) per marcare beta-cellule, Marker 5 (un triangolo vuoto) per marcare le cellule alfa, e Marker 6 ( un triangolo vuoto) per le cellule delta. Le cellule dovrebbero essere segnati al centro del loro nucleo, che apparirà blu se il campione è stato colorato con DAPI.
3. Una volta almeno una cella è stata segnata, visualizzare la "vista ortogonale" utilizzando l'icona nel menu in alto. Controllare "Z-Filter" e "simmetrica". La gamma di should essere impostato a 15,00. A partire dal livello 0,0 Z, scorrere l'isolotto con la rotellina del mouse e contrassegnare ogni cella con il marker appropriati. Ogni cella deve essere contrassegnato solo una volta al centro della sua profondità. Dopo aver finito la marcatura ciascuno dei livelli-Z, la casella di controllo "Z-filtro" può essere selezionata. Questo mostrerà tutti i marcatori da tutti i Z-livelli.
4. Quando ogni cellula è stata segnata, salvare il file come un file "DAT", quindi andate su File → Esporta Tracing. Salva il tracciato come file "TXT". Fare clic su "Nuovo file di dati" per cancellare il lavoro prima di tentare di mappare nuove isole.

5. Rappresentante dei risultati:

La preparazione di sezioni virtuali di un campione pancreas immunoistochimiche colorato permette di esaminare tutte le cellule endocrine (alfa, beta e delta-cellule) nel pancreas intero, sia insieme come isolotti (Figura 1A) e singolarmente, in canali separati ( Figura 1B). Con l'aiuto di programmi informatici e gli script, una analisi della massa di dati su larga scala possono essere eseguite su tali sezioni virtuali. In particolare, l'analisi delle particelle di maschere composito (Figura 1C) è uscita come una tabella statistica contenente parametri come zona isolotto, il perimetro (la distanza che circonda una zona), la circolarità (un grado di rotondità, dove 1.0 rappresenta un cerchio perfetto), e diametro Feret (la distanza più lunga in uno spazio) per ogni isolotto rilevato (Figura 1D). L'analisi su larga scala di questi risultati le immagini nella produzione del numero totale delle isole e istogrammi distribuzione delle dimensioni, nonché un confronto dettagliato di alfa, beta-e delta-cell aree. Inoltre, ogni fetta è presa virtuale ad una profondità di circa 5 micron, e tutte le singole sezioni 2D virtuali sono ulteriormente impilate per creare una ricostruzione 3D del campione del pancreas intero. Mappatura isolotto dimostra un altro esempio non solo di catturare isolotti in 3D, ma anche di dettagliate computer-assistiti di analisi. Mappatura isolotto consiste nella cattura di isolotti distinti (Figura 2A) e la successiva marcatura di alfa, beta-e delta-cellule a diversi Z-piani (Figura 2B) per visualizzare un isolotto in 3D (Figura 2C, D). Automatizzata analisi matematica di isolotti mappate mostra la loro composizione cellulare e architettura, tra cui cellula-cellula distanze (2E Figura) e le probabilità cumulativa di cellula-cellula distribuzioni distanza (Figura 2F).

Figura 1. Larga scala la cattura e l'analisi della distribuzione delle isole utilizzando fetta virtuale. A. virtuale vista fetta di una sezione del pancreas umano. a. La colorazione immunoistochimica per l'insulina (verde), glucagone (rosso), la somatostatina (bianco) e DAPI (blu). b. Convertite a 8-bit maschera dopo soglia automatica. Una zona in scatola è ingrandita nella Visto BB di ogni canale. a. delta-cellule, b. beta-cellule, c. alfa-cellule, e d. fuse immagine composita. L'analisi delle particelle C. intervento su maschera composito. Si noti che ogni struttura isolotto tra piccoli ammassi cellulari è numerato (evidenziato in blu). Tabella D. Le statistiche dei vari parametri misurati per le singole strutture, che hanno ID che corrispondono ai tag mostrato in C.

Figura 2. Analisi di immunoistochimica fetta virtuale. A. grafico a dispersione 3D della figura 1 mostrano la distribuzione dimensione e la forma di ogni isola da parametri quali area, circolarità e del diametro di Feret. B. grafico a dispersione in 3D di Figura 1 che mostra composizione cellulare delle isole e le dimensioni. C. distribuzione delle dimensioni Isolotto di tutta l'analisi sezione umano dalla Figura 1 montato su una distribuzione lognormale densità di probabilità. D. Analisi matematica dei rapporti di composizione cellulare (beta-cellule nel verde, alfa-cellule in rosso e delta-celle in blu) per ogni bin isolotto diametro effettivo di Figura 1. E. a. Isolotto distribuzione delle dimensioni di analisi immunoistochimica campionamento casuale (a sinistra). Isolotto distribuzione delle dimensioni di analisi fetta virtuale (a destra). b. Log-normale confronto trama di analisi immunoistochimica campionamento casuale (rosso) e slice virtuali (blu).

Figura 3. Islet mappatura e l'analisi matematica di composizione cellulare e architettura. R: cattura dello schermo che mostra un unico piano focale da una pila di immagini 3D ricostruito di un isolotto umano caricato in Stereo-Investigator (beta-cellule in verde, alfa-cellule in rosso, delta-celle in bianco, e nuclei in blu) . B: le immagini a fluorescenza (a sinistra) e corrispondenti dati mappati (a destra) in tre differenti piani focali mostrato ad un intervallo di 10 micron. C: vista Rappresentante dei dati isolotto 3D ricostruito la mappatura. D: ricostruzione 3D dei quarti di fette isolotto sulla base delle coordinate ottenute dalla mappatura isolotto. E: Analisi Matematica di composizione cellulare e architettura. Left. Frequenza relativa di cellula-cellula distanze tra due cellule in una popolazione singola cella. A destra. Frequenza relativa di cellula-cellula distanze tra due diverse popolazioni cellulari. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) prova. A sinistra. Probabilità cumulativa di cellula a cellula-distribuzioni distanza per alfa-to-alfa, beta-to-beta e delta-to-delta cellule. A destra. Distanze KS per la corrispondente tre probabilità cumulativa.

Discussion

Il computer-assistita su larga scala di visualizzazione e quantificazione qui presentati permettersi quattro punti chiave per gli studi delle isole pancreatiche: (1) Una grande analisi di campioni del pancreas fornisce una visione completa della distribuzione complessiva dimensioni e l'architettura isolotto isolotto. (2) La ricostruzione 3D e analisi matematica di composizione cellulare e architettura facilitare ulteriormente l'esame della disposizione spaziale delle cellule endocrine all'interno di un isolotto. (3) plasticità isolotto Colpire tra specie diverse e nella stessa specie in diverse condizioni fisiopatologiche può suggerire l'adattamento evolutivo acquisito in risposta ai cambiamenti metabolici, piuttosto che differenze di specie. (4) Il riordino della composizione endocrino cellulari e l'architettura delle isole, insieme a cambiamenti nell'espressione genica certo, può riflettere l'adattamento isolotto nelle sue proprietà funzionali, il che suggerisce ulteriormente l'importanza del ruolo della rete cellulare intraislet endocrino.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook		Program	Olympus