זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.
אנחנו כבר לומדים את הביטוי הפונקציונלי התפקידים של מתח מגודרת ערוצי אשלגן עצב פירמידליים מ הניאוקורטקס חולדה. בגלל חוסר של סוכנים תרופתי ספציפי עבור הערוצים הללו, נקטנו בגישה מניפולציה גנטית לביטוי הערוץ. אנו משתמשים להכנת תרבות organotypic (16) על מנת לשמור על מורפולוגיה של תאים דפוס למינרית של קליפת המוח. אנחנו בדרך כלל לבודד פרוסות neocortical חריפה על 8-10 ימים לאחר הלידה ולשמור את פרוסות בתרבות עבור 3-7 ימים. זה מאפשר לנו ללמוד נוירונים בגיל דומים לאלה של העבודה שלנו עם פרוסות חריפה ממזער את התפתחות הקשרים מעוררים התוסס של הפרוסה. אנו להקליט עצב פירמידליים חזותית מזוהה שכבות II / III או V באמצעות תאורה אינפרא אדום (IR-) הפרעות ההפרש מיקרוסקופיה לעומת זאת (DIC) עם מהדק תיקון כל תא מהדק מתח הנוכחי או. אנו משתמשים transfection biolistic (אקדח ג'ין) של סוג בר או דנ"א מוטנטי ערוץ אשלגן לתפעל הביטוי של ערוצי ללמוד את תפקידם. התאים transfected מזוהים בקלות אחרי transfection בשיתוף עם cDNA עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. אנו משווים הקלטות של תאים transfected אל, נוירונים סמוכים untransfected באותה השכבה של פרוסה אחת.
אנחנו כבר לומדים את הביטוי הפונקציונלי התפקידים של מתח מגודרת ערוצי אשלגן עצב פירמידליים מן החולדה הניאוקורטקס (4, 11/09). בגלל חוסר של סוכנים תרופתי ספציפי עבור הערוצים הללו, אנו משתמשים בגישה מניפולציה גנטית לביטוי ערוץ (1,14,15,17-19). אנו מנצלים להכנת תרבות organotypic (2,3, 5-8; 1…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות Mayumi Sakuraba ורבקה Foehring לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל. בנוסף, אנו רוצים להודות בני הזוג. רודריגו אנדרדה לסיוע ביישום תרבות פרוסה organotypic ופרוטוקולים transfection biolistic וד"ר ג'ין Nerbonne לספק לנו בונה cDNA עבור transfection. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק: NS044163 מ NINDS (עד RCF).
Surgery / transfection / culture:
Media:
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording: