Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Summary

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Abstract

Biz sıçan neokorteks piramidal nöronlar gerilim-kapılı potasyum kanalları ifade ve işlevsel roller eğitim görüyor. Çünkü bu kanallar için özel farmakolojik ajanların eksikliği, kanal ifade işlemek için genetik bir yaklaşım almıştır. Biz hücre morfolojisi ve korteks laminer desen korumak için bir Organotipik kültür hazırlama (16) kullanın. Biz genellikle doğum sonrası gün 8-10 akut neokortikal dilim izole ve 3-7 gün boyunca kültür dilimleri korumak. Bu, bize benzer bir yaşta akut dilimleri ile çalışmalarımızı bu nöronların çalışma sağlar ve dilim coşkulu eksitatör bağlantılarının gelişimi en aza indirir. Biz akım veya voltaj-klemp tüm hücre yama kelepçe ile kızılötesi aydınlatma (IR) ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (DIC) kullanarak katmanları II / III veya V görsel tespit piramidal nöronlar kaydı. Biz onların fonksiyonu çalışma kanalları ifade işlemek için yabani türü veya potasyum kanal DNA mutant Biyolistik (Gen tabancası) transfeksiyon kullanın. Transfekte hücreleri kolayca yeşil flüoresan protein (GFP) için cDNA ile birlikte transfeksiyon sonra Epifloresans mikroskobu ile tanımlanır. Biz transfekte hücreler bitişik, aynı dilim aynı katmanda untransfected nöronlar kayıtları karşılaştırın.

Protocol

1. Dilimleme Gün Öncesi Yapılan Hazırlıklar

Biz bu cerrahi aletler otoklav ve dilimleme gün önce çözümler hazırlamak için daha verimli buluyorum.

1. Otoklav aletleri. (Cerrahi ve dilimleme yarı steril koşullar altında yapılır). Otoklav kağıt ayrı ayrı sarılmış aşağıdaki paketleri, Otoklav:
   • Cerrahi paketi: spatula, # 22 neşter bıçak sapı, makas, forseps
   • Dilimleme paketi: 3 düğme (bıçak tutma düğmesi ve 2 banyo-güvence düğme) ve bıçak muhafazası (dilimleme jilet tutar: Chipping Vibroslice # MA572) (dondurucuya konulur, çünkü), ayrı ayrı sarılmış özel (metal haznesi yaptı dilimleme makinesi (üretici pleksiglas bir tekrarlanan otoklav dayanamaz), hemostat, makas, forseps için örnek banyo).
   • Züccaciye paketi: 50 ml iki bardak ve bir 25 ml beher
2. Kısım at serumu (donör Hyclone at # SH 30.074: Thermoscientic). Kısım ~ 11 ml, 15 ml konik tüpler içine at serumu. (10 ml serum ihtiyaç vardır. Kabarcıkları serum çözülmüş olduğunda, gerekli 10 ml aspire olan 11 mL gereken form için). -20 ° C derin dondurucuda saklayın serum aliquoted.
3. Kısım medya. Medya şişe açıldıktan sonra, onlar ~ 4 hafta (pH değişiklikleri nedeniyle) sadece istikrarlı. Dilim taze medya ile daha iyi yaşayamaz.
   • Biz üç tip piyasada bulunan medya (500 ml şişe satın), artı at serumu kullanın. Medya: HMEM (Biowhittaker Lonza Minimal Essential Media plus HBSS ve HEPES, glutamin: Katalog # 12-137F), HBSS (Gibco Hanks tamponlu serum fizyolojik, # 24.020-117), ve MEM (Gibco minimal temel, orta, # 12360 - 038). Tablo 2'ye bakınız.
   • Üç tip medya (HMEM, HBSS ve MEM) her biri için, kısım ~ dört 50 ml konik tüplerin her birine bir ortam 500 ml şişe 50 ml. Parafilm aliquoting sonra bütün tüpler. Buzdolabında saklayın MEM, ve mağaza HMEM ve oda sıcaklığında HBSS.
   • Kültür ortamı at serumu, HMEM ve HBSS (bkz. aşağıda, Tablo 2) oluşan bir karışım oluşur. MEM yıkama medya olarak kullanılır.
4. (Tablo 3) Kesim Çözüm olun. NaCl 125, 3, KCl NaH ₂ PO ₄ 1.25, NaHCO ₃ 26, 2 mM CaCl _2, 2 mM MgCl _2, ve 20 mM glukoz: Kesme Çözüm (mM) oluşmaktadır. Biz genellikle 250 mL ölçülü balona hacim getirmek olun. Osmolalitesi (~ 310 olmalıdır) ve pH (7.2-7.3).

Müteakip Adımlar (# 2 ve # 3) Kesme gününde yapılmaktadır.

2. Cerrahi, dilimleme ve Organotipik Kültür

Diğer tüm prosedürler göre ayrı bir yerde ameliyat gerçekleştirmek için önemlidir. Biz beynin çıkarılması için cerrahi için bir vakum (duman) kaput kullanın. Laminer akış kaputu dilimleme ve dilimleri ve çözümler manipülasyonları gibi yarı steril koşullar altında yapılan işlemleri için kullanılır.

1. Çözümleri hazırlayın. (Bu prosedürler çözümleri, bir sonraki adımda filtre olacak gibi steril koşullar altında yapılabilir gerek yoktur.)
   1. Kesme Çözümü (Tablo 3) hazırlayın. O en az 20 dakika (pH stabilize etmek ve tüm tuzları çözelti içinde olduğundan emin olmak için)% ₂ / 5 CO ₂ ile% 95 oranında bir karışım Bubble çözüm. 1 mM pirüvik asit (metabolik inhibitörü) and0.6 mM askorbat (antioksidan) ekleyin.
   2. Çözülme 1 kısım at serumu (11 ml).
2. (EtOH ile eldiven doyurabilecek, tüm prosedürler için eldiven giyin) laminer akış kapağı hazırlayın. Bu bölümde, çalışma alanı, yarı steril temiz bir çalışma alanı sağlamak için hazırlar. Biz de onları sterilize etmek için çözümler filtre.
   1. Laminer akış kaputu içinde çalışma alanı yaklaşık 1 saat süreyle sterilize etmek için UV ışığı kullanın (biz dilimleme için kullandığınız theCampden Vibroslice kapağı böylece UV ışığı plastik parçalar zarar verecek, aşağıya bakınız). (: EtOH zarar verecek dilimleme makinesi, plastik düğmeleri hariç)% 70 EtOH ile tüm yüzeyleri temizleyin. Laminer akış kaputun altında da genellikle% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ve 100 O ₂ bağlı pipetter ve pipetler, EtOH şişe, tutkal, ve tüp.
   2. Laminer akış kaputu altında aşağıdaki yerleştirin:
      • Otoklavlı dilimleme paketi
      • 250 ml Kesim Çözüm
      • Kesme Çözüm filtre Millipore ifade artı filtresi: 250 ml [0.2 mikron filtre (# SC6PU02RE)]:
      • Kültür Medya Bileşenleri:
        • 20 ml HMEM
        • 10 ml HBSS
        • 10 ml at serumu
      • Züccaciye paketi: otoklavlanmış bardak
      • MEM yıkama medya 50 ml
      • Pipetter (Drummondpipetlemeyin-yardım)
      • Seven plastik transferi pipetler (Fisher # 13-711-20). Bu çözümler ve medya köpürme dilimleri ve çözümlerin yanı sıra, gaz çözümleri için kanal olarak hizmet etmek için (% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ O ₂₎ aktarmak için kullanılır.
      • Siyanoakrilat yapıştırıcı
      • Traş bıçağı veya makas (plastik kesmek için).
      • Steril # 22 neşter bıçak
      • Millicell hücre kültürü ekler (0.4 mikron, 30 mikron çapında, # PICM 03.050), her 6-plaka için 3 ekler
      • 6-kuyu kültür plaka (lar) (Corning: Costar # 3516)
   3. Filtre hazırlanan 250 mL Kesme Çözüm 250 ml Millipore filtresi (bkz. yukarıda) kullanarak.
      Kısım 40 ml, 50 ml beher içine Çözüm Kesme. Çözüm ve Kesim Kesim Çözüm kalan dondurucuda (-20 ° C) 210 ml, 40 ml kısım yerleştirin. Amaç, ıslak bir karışım olarak ~ 4 ° C (beherindeki 40 ml) kafatası çıkarıldıktan sonra beyin almak için ve kesim için (210 ml) bu çözümleri kullanmalarını.
   4. -20 ° C derin dondurucuya yerleştirin metal dilimleme odası (otoklav kağıt kaplı). Bu dilimleme sırasında Kesme Çözüm ve beyin soğuk tutmaya yardımcı olur.
   5. Kültür Ortamı hazırlayın ve kuyular (kabarcık Kültür Medya - köpüğü olacak) koymak.
      • 40 ml, 50 ml plastik santrifüj tüpüne Kültür Ortamı hazırlayın:
        • 20 ml HMEM + 10 ml HBSS + at serumu 10 ml kısım (Tablo 2) karıştırın
        • 50 ml Millipore steriflip 0.22 mcM filtresi (# SCGP00525) kullanarak Filtre Kültür Medya (sterilize etmek).
      • 6 plaka 3 çapraz aralıklı kuyuları (Costar # 3516 6 kuyu kültür küme Corning) içine yerleştirin 1.1 ml Kültür Medya. 37 içine yerleştirin 6 plaka / Kültür Medya en az bir saat ° C inkübatör.
   6. Steril makas veya jilet ile, 4 transfer pipetleri (dilim aktarmak için kullanın) kısaltır. Kesilen boru uçları köpüren çözümleri için gazları dağıtmak için daha fazla değişiklik yapmadan kullanılır. Bu tüpler% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ veya% 100 O ₂ çözümlere tankları hatları bağlamak.
   7. Filtre Yıkama Media (50 ml) 50 ml Millipore steriflip 0.22 mcM filtresi (# SCGP00525) kullanarak. Yıkama Medya buzdolabına yerleştirin.
3. Ameliyat için hazırlanması. Çözümler ameliyat sonrası beyin (vakum kaput) kabul etmek ve dilimleme ve kültür için hazırlık (laminer akış kaput) hızlı izin vermek için hazır olmalıdır. Biz bir vakum başlığı altında ameliyat. Cerrahi, saç ve vücut sıvıları, yarı steril laminer akış kaputu uzakta tutmak için ayrı bir alanda yapılması önemlidir.
   1. Medya ve çözümler hazırlayın.
      • 40 ml Kesme Çözüm dondurucu ile 50 ml beher çıkarın ve kafatası çıkarıldıktan sonra beyin almak için vakum kaputun altında koymak. ~ 10 ml, 25 ml beher bu soğuk Kesme Çözüm dökün. Bu laminer akış kaput beyin taşıma kullanılır.
      • 210 ml Kesme Çözüm dondurucudan çıkarın ve laminer akış kapağı koymak (dilimleme ve dilim toplanması için).
      • Dondurucu metal dilimleme odasına çıkarın ve laminer akış kaputun altında koymak.
      • Kabarcık her ikisi _de% 95 O _{2 /%} 5 CO 2 (çözüm boru bağlamak için kesilmiş plastik transferi pipetler) çözümler kesim.
   2. Vakum başlığı altında aşağıdaki öğeleri (30 ml Kesme çözüm zaten mevcut ve% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile köpüren) Yeri:
      • 25 ml beher otoklava
      • Otoklavlı cerrahi aletler, eldiven, forseps
   3. (Kesilmiş plastik transferi sonunda pipet kullanmak çözüm tüp bağlamak için)% 100 O ₂ ile buzdolabı ve kabarcık Medya yıkayın çıkarın.
4. Ameliyat (vakum akışı kaputu altında yapılan). Bu adım, dilimleme sonraki beyin kaldırmak için gereklidir. Hayvan kurban ve soğuk, oksijenli Kesme Çözüm beyin yerleştirerek arasındaki süreyi en aza indirmek için önemlidir. Beyin travmayı en aza indirmek için de önemlidir. Tüm işlemler, Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, Tennessee Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından onaylanmıştır.
   1. P6-P17 (P8-P10 tercih edin), Sprague-Dawley sıçan kullanın. Kapalı 2-4 litrelik plastik konteyner içine yerleştirin sıçan. Anestezi için, ~ 1 ml isofluorane (anestezi hayvan kalmaması) plastik hasır altında bulunan bir gazlı bez parçasına uygulanır. Hayvan areflexive kadar izofluran ile sıçan anestezisi. EtOH ile eldiven Doymuş.
   2. Sıçan uyuşturulduktan sonra, büyük bir neşter ile hayvan başını kesmek ve beyin kaldırmak. Içine beyin koyun30 ml soğuk içeren beher (~ 4 ° C) ~ 30 sn Kesme çözümü. Dikkatle beyin laminer akış kaputu, saç ya da kan transferi en aza indirmek için 25 ml beher transfer.
   3. Değişim eldiven (EtOH ile doyurabilecek).
   4. Laminer akış kaput soğuk Kesme Çözüm Transfer beyin (25 ml beher).
5. Beyin dilimleyin ve kültür için hazırlamak. Bu adımda, biz yönlendirmek beyin, gereksiz beyin dokusu kaldırmak ve beyin dilim kesmek ve toplamak. Daha sonra dilimler yıkayın süzgeçin her dilim, 6 kuyu kültür plakaları örgü ekler ve kültür için inkübatör levhalar (dilimleri ile) aktarmak.
   1. Her biri bir yarımküreden - Orient ve blok beyin (beyincik ve frontal kutup kaldırmak, Bu iki dilim eşzamanlı kesim sağlar kısmi orta sagital kesim ~ frontal korteks sonundan itibaren yarım ama yine de bir kuyruk sonunda birlikte her iki hemsipheres tutar sahne tutkal kararlı bir temel). Tutkal siyanoakrilat ile sahnede beyin engelledi. Yeri beynin frontal korteks ve frontoparyetal korteksin koronal dilimlemek. Dilim boyutunu sınırlamak için ihtiyaç duyulan ek neşter keser olun.
   2. Steril metal dilimleme odası (titreşimli doku dilimleme makinesi bağlı olduğu) beyin ile sahneye koyun ve buz ile doldurun banyo, Kesme Çözüm köpürme. % 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile 50 ml beher (dilimleri toplamak için) ve kabarcık kalan Kesim Çözüm ~ 30 ml dökün.
   3. Titreşen bir doku dilimleme makinesi (Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, ABD Chipping Vibroslice # MA572) ile 250-300 mikron dilim kesin. 30 ml Kesme Çözüm içeren behere dilimleri yerleştirin. Kültür (genellikle 3-6) isteyen dilim sayısı, artı fazladan birkaç toplayın.
   4. 35 mm plastik Petri kabındaki Yeri ~ 2 mL Yıkama Medya: Dilimler yıkayın. Kesme Çözüm Yıkama Medya ile plastik Petri kabı tüm dilimleri aktarın. Her zaman taze Yıkama Media kullanarak, dilimler, 3 kere yıkayın. Ayrı transferi pipetler, dilimler transfer medya eklemek ve atık çözümleri aspire için kullanın.
   5. Kültür Medya (yeni transfer pipet farklı bir 35 mm plastik Petri kabı) dilim aktarın. Örgü uçlar için ambalaj üstleri çıkarın, fakat ambalaj ekler terk.
   6. Insert (Şekil 1A) ortasında pozisyon dilimleri: Kültür Medya örgü ekler (cuttransfer pipet) Transferi Dilimler. Kültür Medya küçük bir bit dilim ile birlikte gelecektir. Sağlam bir transfer pipet kullanarak, dilim ekleme yerleştirdikten sonra hemen aşırı Kültür Medya çıkarın. (Bu Biyolistik transfeksiyon kolaylaştırır ve daha kolay, daha sonraki kayıt için dilim kaldırmak için yapar) eklemek merkezi dilim konumuna deneyin.
   7. 6 plaka Kültür Medya ağ ekleme / slice (Şekil 1B) yerleştirin. Mesh.When 3 ekler / dilim altında hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkatli olun 6-plaka, yerinde inkübatör 6-plaka geri. ~ 1 saat için 37 ° C inkübatör dilimleri inkübe edin.
6. Gen Tabancası kullanarak Transfect dilimleri (Bio-Rad Helios). Bu 6-plaka dilimleme ve örgü yerleştirme hemen sonra yapılabilir, ancak biz genellikle 37 1 saat süreyle inkübe ° C dilim stabilize etmek ve sonra hücrelerin transfect. CDNA "mermi" ve Gen Tabancası kullanarak detaylı protokoller için, refs bakın. 17-22.
   1. "Mermi" içeren plastik "kartuşları" yükleyin. (Biz mermi gibi cDNA kaplı altın parçacıkları bakın. Böylece, çok sayıda mermi plastik bir "kartuş" yer almaktadır.) Ilk pozisyon bedava (hayır "kartuş") bırakın. Kartuş cDNA-kaplamalı mermi içeren diğer her pozisyonda yükleyin. Gen tabancası kartuşu tutucusu yerleştirin.
   2. Herhangi bir kartuş ile namlu ateş temizle tabanca.
   3. Kartuşu ile varil Advance. 6-plaka laminer akış kaputun altında inkübatör ve yerden çıkarın. 6-plaka üstünden sadece silah tutun. Dik tutun. ~ 100 psi vur.
   4. Avans varil, açık tekrarlayın. Bir dilim başına vurdu.
   5. Çekimden sonra, inkübatör için dilimler / ekler ile 6-kuyucuğu dönün.
7. Kültür dilimleri (yarı steril koşullar altında). Dilimleri ve 6-kuyucuğu tüm manipülasyonlar EtOH ve laminer akış kaputun altında doymuş EtOH alan temizlendikten sonra, eldiven giyen yapılmalıdır. Biz kültür, çeşitli zaman bir süre (genellikle 2-7 gün) dilimleri, akut dilimleme işlemi kurtarma izin ve yeni protein yol transfeksiyon için zaman tanımak için.
   1. 2-7 gün boyunca Kültür (37 ° C,% 5 CO ₂₎ inkübatörde (Forma Bilimsel model # 3110).
   2. Her gün medya değiştirin: en az 1 saat için kuvöz yerine, üç kimse kuyu yeni medya ekleyin. EtOH temizleme kavisli bir forseps ile yeni bir kuyu dilim / membran taşıyın. Soluklueski medya. Inkübatör plakasını dön.

3. Dilimleri Piramidal Hücreleri kayıt

Tüm hücre kayıt teknikleri hakkında ayrıntılı talimat sağlamak için bu protokol kapsamı dışındadır. Biz kayıt odasına dilim aktarmak ve kayıt ayrıntıları hakkında bilgi sağlar ilgilidir kayıt için transfekte hücreler tespit etmek, özellikle set-up.

1. Biz bir Sutter P-87 yatay çektirmesi ile Harvard GC150TF-10 cam elektrotlar çekin. Elektrotlar ekstraselüler çözüm M 2-6. Elektrotlar bir KMeSO ₄ dahili (bkz. Tablo 3) ile doldurulur.
2. Eldiven giyin. 6 plaka inkübatör çıkarın. Laminer akış Kaputun altında, bir dilim / süzgeçin EtOH temizlenmiş, kavisli bir forseps ile dikkatli bir şekilde kaldırın. 6-plaka inkübatörde değiştirin ve kayıt alanında kaydedilen dilim transfer. Bizim örneğimizde bu farklı bir laboratuar. Biz, kapalı bir 35 mm plastik Petri kabı ekleme / dilim taşır. Bu adımdan sonra, eldiven giyilmelidir (kültür veya inkübatör kontamine imkanı) gerek yoktur.
3. # 11 bistüri ile membran kesip. Forseps veya esnek metal çubuğu tarafından sağlanan gerilim karşı kesin. (Bu nihai bir makas ile keser bitirmek için gerekli olabilir). Forseps kullanarak, Olympus BX50 WI dik mikroskop aşamasında kayıt odasına bağlı örgü dilim aktarmak.
4. PClamp 10 Axon Aletleri Multiclamp 700B amplifikatör ve veri toplama protokolleri kullanır. Elektrot pozisyonu Sutter ROE-200 manipülatörler ve PC-200 denetleyici ile kontrol edilir. Biz görselleştirmek için tek IR duyarlı kamera (Olympus OLY-150 veya DAGE MTI) ve ProVideo 1201B monitör piramidal nöron katmanları II / III veya V. görselleştirmek için IR-DIC optik ile Olympus BX 50WI dik mikroskop dilim hücreler. 33 ± 1 ° C 2-3 ml / dak 'da teslim: Dilimler yapay beyin omurilik sıvısı (Tablo 3 aCSF) carbogenated yıkandığı
   Tipik olarak, ortalama 10-50 dilim transfekte hücreleri bulabilirsiniz. Hücreler lookingthrough mikroskop mercek ve FITC filtresi (hedefleri üstünde ve mikroskop mercek altında bulunan bir taret monte bir filtre çarkı üzerine monte) Epifloresans kullanarak bulunmaktadır. Bu bize kolayca hücre (hücre Epifloresans altında yeşil görünür ve bir kurşun içeren) transfekte olduğunu, hücre tipini belirlemek için IR-DIC ve Epifloresans arasında geçiş yapmak için izin verir ve hücre (hücre 3-boyutlu ve pürüzsüz bir yüzeye sahiptir sağlıklı olduğunu , nükleus şişmiş, hücre) şişmiş ya da çekmiş değil.
   Biz piramidal nöron katmanları II / III veya V (bkz. Şekil 1) hedef. Piramidal hücreler, çok sayıda dendritik dikenler ve armut şeklinde soma katmanı doğru artan bir apikal dendrit varlığı ile tanımlanır. Katman pia için göreceli hücre yoğunluğu ve yere göre belirlenir. Genellikle dilim yüzeyinde transfekte hücreleri sağlıklı olmayacaktır. Organotipik dilim içinde akut dilimleri ile daha derin hücreleri görselleştirmek için daha zor olsa da, biz genellikle sağlıklı, 20-50 mm kesit yüzeyinin altında transfekte hücreler oluşturulabiliyor. Biz standart tüm hücre kayıt yöntemleri kullanın. Biz görsel rehberliği altında ve voltaj kelepçe pozitif basınç ile hücre yaklaşım. Contalar voltaj-klemp altında hafif bir emme (1 ml şırınga kullanarak) ile elde edilir. GΩ mühür ulaşmak üzerine, ek emme hücresine kırmak için uygulanır. Daha sonra her iki akım veya voltaj-klemp kayıtları gerçekleştirmek.
   Kaydın sonunda, kaydedilen hücre yeşil olduğundan emin olun, bir kurşun içerir ve gözle görülür bir şekilde negatif veya pozitif basınç yanıt. Dilimleri, hücre tabakaları, ameliyat sırasında yaşı, ve kültür zaman arasındaki değişimi için kontrol etmek için, her zaman aynı katmanda untransfected kontrol hücreleri kayıtları ile transfekte hücreler bizim kayıtları çifti ve 50 mikron transfekte hücre bulunmaktadır.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1A kültür için 6 plaka ekleme membran üzerinde oturan bir akut hazırlanan bir dilim gösterir. Bu dilim P10 sıçan yavru bir motor ve somatosensoriyel korteks içerir. Pia sol beyaz madde ve striatum, figürün sağ. Şekil 1B ~ 1.1 mL Kültür Medya dalmış dilim / membran, iyi gösterir. Organotipik kültür Amacımız korteksin normal laminer desen korumak için, kültür sırasında kuruyan yüzey önlemek ve sonuçta kültür olarak kaydedilebilir birkaç gün sonra dilim canlı hücrelerinin yüksek oranda üretmek için (hücre veya çekmiş değil şişmiş, minimal şişmiş hücre çekirdekleri, IR-DIC optik hücre parlak ve üç boyutlu görünüm). Şekil 1C 3 gün sonra somatosensoriyel korteksin Organotipik dilim bir katman III piramidal nöron IR-DIC ve Epifloresans görüntüleri gösterirkültür (P10 hayvan). Şekil 1D, GFP (yeşil hücreler) için cDNA ile transfekte birkaç katman V hücreleri gösteren farklı bir dilim bir Epifloresans görüntü.

Şekil 2, 3 gün için (P10 hayvan) Organotipik kesit kültürü sonra bir katman V piramidal hücre akım ve voltaj-klemp kayıtları temsilcisi izlerini gösterir. Şekil 2A, bir overshooting aksiyon potansiyeli (AP) gösterir. Şekil 2B, 2 s, 400 pA sabit akım enjeksiyon yanıt tekrarlayan ateş gösterir. Bu izler, düzenli bir spike katmanı V nöronun normal elektrofizyolojik özellikleri (bkz. Tablo 1 de) göstermektedir. Şekil 1C voltaj kapılı Na ⁺ akımları engellemek için 1 mcM tetrodotoxin (TTX) varlığı bir katman V piramidal nöron bir gerilim-kelepçe kayıt. Izleri -70 mV bir holding potansiyeli -90 mV ile +70 mV (adımları arasında 10 mV) arasında çeşitli potansiyelleri 500 ms gerilim adımları yanıt akımların bir aileyiz.

Şekil 1. Organotipik kesit kültürü A. Millicell filtre süzgeçin P10 sıçan sıçan sensorimotor korteks dilimleyin. Pia sağ, derin beyaz cevher ve sol için striatum. Orta hat üst kenarında. B. Üç dilim ve örgü ekler ~ 1 ml Kültür Medya batık ve (A gibi aynı hayvan) 6-plaka Bitişik olmayan kuyular yerleştirilir. C. IR-DIC (üst) ve (alt) Organotipik kültür katmanı III neokortikal piramidal hücre (P10 hayvan, kültür 3 gün) görüntüleri epifluoresent. DIC (siyah küre) görünür "mermi" Not. D. GFP için cDNA Biyolistik transfeksiyon sonra birkaç kat V nöronların Floresan görüntü.

Şekil 2. Organotipik dilim kültür neokortikal piramidal hücrelerin Kayıtlar A.. Suprathreshold 10 ms akım enjeksiyon yanıt tabaka III piramidal hücre aksiyon potansiyeli (P10 hayvan, kültür 3 gün sonra). 2 s, 400 pA akım enjeksiyon yanıt farklı bir katman V piramidal nöron (P10 sıçan, kültür 3 gün) B. Tekrarlanan ateş. Bu düzenli bir spike nöron oldu. C. farklı bir katmana V piramidal nöron (P10 sıçan, kültür 3 gün) Voltaj-klemp kaydı. 1 mcM TTX voltaj kapılı Na ⁺ güncel blok mevcut. Hariçte, K ⁺ -70 mV (protokol sağda) bir holding potansiyeli 500 ms gerilim adımları bir aile yanıt akımlar. Gerilimleri 10 mV sıvı kavşak potansiyeli için düzeltilmiştir. Erişim direnci M 9 ~. Seri direnç için herhangi bir tazminat veya membran kapasitans istihdam edilmiştir.

Tablo 1. Kontrolü vs GFP-transfekte piramidal hücreleri (in vitro 3-4 gün Organotipik dilim dilim p10 sıçan) Benzer elektriksel özellikleri. Ortalama + Ortalama Standart Hata (hücre sayısı). RMP = istirahat membran potansiyeli, Rn = giriş direnci, AP = aksiyon potansiyeli; AP için V. = gerilim eşik; HW = AP genişliği yarım genlikte.

Tedavi	RMP (mV)	Rn (M)	AP genlik	V. (mV)	HW (ms)
Kontrol	-72 ± 1 (21)	119 ± 17 (11)	84 ± 2 (24)	-45 ± 1 (21)	1.7 ± 0.1 (19)
Sadece GFP	-77 ± 1 (9)	123 ± 7 (5)	87 ± 2 (24)	-45 ± 2 (9)	2.1 ± 0.2 (7)

Tablo 2. Ticari Medya bu medya değiştirilmemiş (Onların eserleri üreticisi on-line) satın alınmış ve kullanılmıştır.

¹ yıkayın Medya: MEM (Gibco # 12360)
Kültür Medya: 20 ml HMEM ¹ (Lonza Biowhittaker) + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24.020-117) + 10 ml at serum1 (Hyclone # SH 30.074,03. )

Tablo 3. Çözümler (mM konsantrasyonları).

Kesme 125 NaCl, 3 KCl, CaCl 2, _{2, 2} MgCl 2, 1.25 _NaH 2 _PO 4, 26 _NaHCO 3, 20 glikoz (pH 7.4, 310 mOsm / L): Çözüm .
Yapay Beyin Omurilik Akışkan aCSF (harici kayıt): 125 NaCl, 3 KCl, CaCl _2, 2, 2 _{MgCl 2,} 1.25 _NaH 2 _PO 4, 26 _NaHCO 3, 20 glikoz (pH 7.4, 310 mOsm / L) .
İç Kayıt (akım klemensi): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7.5 NaCl, 2 MgCl _2, 10 Hepes 2 ATP, GTP 0.2, 0.1 EGTA (pH 7.2, 285-295 mOsm / L).
İç Kayıt (voltaj-klemp): 55 KMeSO _4, 55 KOH, 2 MgCl _2, 20 Hepes, 6 kreatin fosfat, 4 ATP, GTP 0.5, 10 BAPTA, 0.1 leupeptin (pH 7.2, 285-295 mOsm / L).

Discussion

Biz sıçan neokorteks (4, 9-11) piramidal nöronlar voltaj bağımlı potasyum kanalları ifade ve işlevsel roller eğitim görüyor. Çünkü bu kanallar için özel farmakolojik ajanların eksikliği, kanal ifade (1,14,15,17-19) işlemek için genetik bir yaklaşım kullanır. Hücre morfolojisi ve korteks laminer düzenini korumak için Stoppini ve ark (16) yaklaşım değiştirilmiş. Organotipik kültür hazırlanması (12,13,15-22; 5-8 2,3) kullanır. Biz 6-17 postnatal gün akut neokortikal dilim izole ve 2-7 gün boyunca kültür dilimleri korumak. Bu bize benzer yaşlı nöronların bu akut dilimleri ile çalışma sağlar ve dilim coşkulu eksitatör bağlantıları gelişimini en aza indirir. Biz kızılötesi aydınlatma (IR) ve akım veya voltaj-klemp tüm hücre yama kelepçe ile diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (DIC) kullanarak katmanları II / III veya V görsel olarak belirlenen piramidal nöronlar kaydı. Biyolistik yabani türü veya mutant potasyum kanal DNA (Gen tabancası) transfeksiyon fonksiyonu (1,14,15,17) çalışma kanalları ifade işlemek için kullanılır. GFP için cDNA ile birlikte transfeksiyon, transfekte hücreler Epifloresans mikroskobunda kolayca tespit edilir. Biz transfekte hücreler bitişik, aynı dilim (1,17) aynı katmanda untransfected nöronlar kayıtları karşılaştırın.

Yok burada ele prosedürlerinin zor sonuçları büyük ölçüde artırabilir, ancak birkaç ayrıntıya dikkat. Bizim ellerde, hücre canlılığı, kültürleri ~ P8-P10 hayvanlar dilim yapıldığında en iyisidir. Dilim dilimleme ve kültür sırasında yarı steril koşullarda korumak için önemlidir. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için, biz aletler otoklav ve UV ışığı ve EtOH, filtre çözümleri, eldiven, beyin kaldırma ve dilimleri arasındaki değişim eldiven ve cerrahi alanını temiz. Bakteriyel kontaminasyon sonuçları kötü doku canlılığı ve inkübatörler arındırma gerekliliği içerir. Tüm beyin dilimleri ile gibi, canlılığı, hayvanın kurban arasındaki zamanı en aza indirmek ve dilimleme tarafından geliştirilmiştir. Beyin konulmalıdır ve dilimleme Kesme Çözüm buz gibi bir bulamaç batmış beyin ile yapılmalıdır. Bıçak düşük genlik yatay titreşim ile, yavaş hızda dilimleyin.

Bir diğer potansiyel sorun inkübatör dilimleri kuruma. Sınırlı ilgi korteks ve striatum (oryantasyon amaçlar için) küçük bir parça: Kurutma küçük dilimleri hazırlanması ile minimize edilebilir. Büyük dilim inkübatör kurumasına eğilimindedir ve büyük dilimleri ile istikrarlı bir kayıt koşullarını elde etmek için daha zordur. Dilimler, 250-300 mikron kalınlığında kesilir. Bulduğunuz ince dilim (250 mikron tercih) daha az kurutma sonucu. Inkübatör kesim çözüm dilim aktarırken, sonra yıkayın Medya Kültür Medya ilk dilim birkaç kez yıkayın ve. Membran (dilim örgü eklemek için izin) transferinden sonra aşırı sıvı kaldırmak için önemlidir. Kurumasını önlemek için kalın dilim (örneğin, 300 mikron), Medya dilim üst tempolu Kültür tek bir damla (membran üzerine oturmuş iken) yardımcı olur. Bu prosedür, dilimin üst yüzeyi nemli bir medya hareketi prime görünür. Her gün Kültür Medya Değiştirilmesi kurumayı önler ve canlılığı teşvik.

Materials

Surgery / transfection / culture: Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413) disposable supplies for Helios from Bio-Rad: 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264 Tefzel Tubing: #165-2441 Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). Media: Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525) Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording: Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).