Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex
Summary
Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.
Abstract
Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos. Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, temos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal. Nós usamos uma preparação cultura organotípicas (16) a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do córtex. Normalmente, isolar aguda fatias neocortical menos 8-10 dias pós-parto e manter as fatias em cultura por 3-7 dias. Isto permite-nos estudar neurônios em uma idade semelhantes aos de nosso trabalho com fatias aguda e minimiza o desenvolvimento de exuberante conexões excitatórias nos fatia. Nós gravar a partir de visualmente identificados neurônios piramidais em camadas II / III ou V com uma iluminação de infravermelho (IR) e microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) com grampo toda célula patch em corrente ou tensão-clamp. Usamos transfecção (arma Gene) biobalística do tipo selvagem ou mutante DNA canal de potássio para manipular a expressão dos canais para estudar sua função. As células transfectadas são facilmente identificados por microscopia de epifluorescência, após a co-transfecção com cDNA para a proteína verde fluorescente (GFP). Nós comparamos as gravações de células transfectadas com adjacentes, os neurônios untransfected na mesma camada da mesma fatia.
Protocol
Discussion
Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos (4, 9-11). Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, usamos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal (1,14,15,17-19). Nós utilizamos uma preparação organotípicas cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificado a partir da abordagem de Stoppini et al (16), a fim de manter a morfologia das células eo padr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Mayumi Sakuraba e Rebecca Foehring de assistência técnica excepcional. Além disso, gostaríamos de agradecer as Dras. Rodrigo Andrade de assistência na implementação da cultura fatia organotípicas e protocolos de transfecção biobalística e Dr. Jeanne Nerbonne para fornecer-nos com construções cDNA para transfecção. Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenção: NS044163 de NINDS (para RCF).
Materials
Surgery / transfection / culture:
- Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
- Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
- Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
- Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
- disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
- 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
- Tefzel Tubing: #165-2441
- Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).
Media:
- Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
- HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
- Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
- 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording:
- Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
- Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
- Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
- Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
- IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
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