Summary
Immunocytochemistry은 존재, subcellular 지방화 및 교양 세포에 대한 관심의 항원의 상대적인 풍부를 결정하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 하나가 항체를 절약 하나의 얼룩을 최대한 활용 수있게 단계 시리즈.
Abstract
Immunocytochemistry은 존재를 결정하는 매우 강력하고 매우 간단 방법, subcellular 지방화, 그리고 가장 일반적으로 흥미, 교양 세포에있는 단백질의 항원의 상대적인 풍부합니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 자신의 얼룩 밖으로 고품질 재현할 질적 및 양적 데이터를 가져오는 동안 연구자 기본 및 보조 항체를 보존하기 위해 사용됩니다 단계 시리즈. 얼룩에 필요한 항체의 볼륨을 보존하는 데 도움이 프로토콜의 두 측면이 있습니다. 하나의 세포는 조직 문화 판의 우물에 배치됩니다 작은 원형 coverslips에 성장하고 있습니다. 고정 후 coverslips에있는 세포는 접시의 우물에서 제거할 수 있습니다. 항체 얼룩 경우, 세포와 coverslip은 parafilm에 대한 항체 솔루션의 작은 방울로 반전하고 건조 방지하기 위해 parafilm의 두 번째 조각으로 덮여있다. 이 방법을 사용하여 항체 솔루션만이 ~ 25 μl가 물들다 각 coverslip (또는 샘플) 필요합니다. 이 프로토콜은 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)의 immunostaining 설명하지만, 많은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.
Protocol
1 일 : 독일어 유리 Coverslips 준비 및 심는 세포
참고 : 독일어 유리 coverslips 자주 culturing 주요 신경 줄기 세포 뉴런에 바람직합니다. 우리는 세포 접착 및 확산을 개선하기 위해 다음과 같은 청소 프로토콜을 사용합니다. coverslip 양쪽에 액체 액세스를 허용하는 작은 랙에 위치 coverslips. 첫째, 10 분 1 % Liquinox에서 품어의 coverslips는 탈이온수 3 씻는다 다음. 어떤 비누 거품이 남아도는지 확인합니다. 다음, 30 분 1M HCL에 품어 전표는 탈이온수 3 씻는다 다음. 65 드라이 coverslips ° C 하룻밤. 유리 접시와 소독을 압력솥에 coverslips을 전송.
- 조직 문화 후드에서 적절하게 크기 잘 플레이트에 살균 coverslips를 배치합니다.
- 세포 유착에 대한 laminin과 외투 coverslips. 10 μg / 실온에서 5 분간 살균 물에 ML 폴리 D - 라이신 (PDL)의 부화의 coverslips. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 하루 4 시간 또는 EMEM 20 μg / ML의 laminin의 PDL과 부화 coverslips를 제거합니다.
- 참고 : Passaging 인간 신경 줄기 세포 문서 (참조 http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) 및 계산 인간 신경 줄기 세포 문서 ( http://www.jove.com / 색인 / Details.stp? ID = 262 hNSPCs을 resuspend하고 계산하는 방법을 알아보려면).
- 참고 : Passaging 인간 신경 줄기 세포 문서 (참조 http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) 및 계산 인간 신경 줄기 세포 문서 ( http://www.jove.com / 색인 / Details.stp? ID = 262 hNSPCs을 resuspend하고 계산하는 방법을 알아보려면).
- 각 coverslip 함유 특정 밀도 (우리는 종종 우리가 immunostaining에 대한 도금하는 세포에 대한 세포 100,000-300,000 / ML의 초기 도금 밀도를 사용)에서 잘으로 PBS 및 종자 세포와 laminin - 코팅 coverslips 린스.
- 37 플레이스 플레이트는 세포가 coverslips (보통 필요 4 시간 최소)을 준수 ° C 조직 문화와 보육을 허용합니다.
일 2 : 고정, Permeabilizing, 차단하고, 세포 차 항체를 추가
참고 : 우리는 세포 형태를 유지하기 위해 다음과 같은 4 % paraformaldehyde의 정착액을 사용합니다. 조리법은 paraformaldehyde이 솔루션으로 갈 수 있도록하는 산도의 변화를 포함합니다. 높은 기온이 형광을 사용하면 배경 얼룩을 높일 수 산성 개미의 생성으로 이어질 수 있기 때문에 우리는이 방법보다는 paraformaldehyde를 해산하기 위해 열을의 사용을 선호합니다. 다른 전반적인 형태 (자당)을 유지하는 데 도움이 동안 정착액 도움의 일부 구성 요소, cytoskeletal 구조 (MgCl 2 EGTA)를 보존합니다.
전지 4 % Paraformaldehyde의 정착액
| 시약 및 단계 | 정착액 100 ML에 대한 금액 : |
| MilliQ 물 | 75 ML |
| Paraformaldehyde (펌 후드에서 달다) | 4g |
| 10N NaOH는 저어 및 솔루션이 나올 때까지 dropwise 추가 | 필요에 |
| 10X PBS | 10 ML |
| 1M MgCl 2 | 0.5 ML |
| 0.5 M EGTA | 2 ML |
| 자당 | 4g |
| 6N HCL, pH를 7.4로 적정하다 | 필요에 |
| MilliQ 물 | 100 ML 가져다 |
| 최대 1 주일 4 ° C에 보관하십시오. 37 따뜻한 ° C 사용하기 전에 | |
- 벤치에서 미디어를 제거하고 prewarmed 정착액을 추가합니다. 5-15분 (감지하는 항원에 따라, 우리가 일반적으로 10 분 사용)을 품어. 이것을 실온에서 다음 단계를 수행합니다.
- 많은 기관들이 유해 폐기물로 paraformaldehyde를 처리 등 적절한 용기에 정착액 폐기하십시오. PBS로 세포를 3 번, 5 분 때마다 씻으십시오. 세포에서 솔루션을 제거하는 경우, 흡입은 세포를 건조하게 만들지 않는 것을주의하십시오. 또한, 항상 외투 그들은 너무 세포가 건조 왼쪽으로하지 않는 솔루션을 제거하기 전에 세포에 추가 반면에 다음 해결책을 가지고 있습니다.
- 관심의 항원은 세포 내부, 세포막은 항체의 진입을 허용 투과하여야하는 경우. 세포를 permeabilize하기 위해 PBS에 신선한 0.3 % 트리톤 X - 100 용액을 사용하십시오. 피펫 천천히 Triton은 점성이며, 세제가 완전히 세포에 추가하기 전에 PBS에 용해되어 있는지 확인 때문입니다. PBS 5 분마다있는 세포에게 3 번 씻는 다음 5 분 세포를 Permeabilize.
- 세포는 항체가 아닌 특정 바인딩을 방지하기 위해 차단 에이전트로 치료해야합니다. 우리는 차단 요원으로 (BSA) 소 혈청 알부민을 사용합니다. (이것은 용해 시간이 걸립니다 때문에 락커 또는 회전)를 차단 솔루션 PBS로 5 % BSA를 용해 만든 후 솔 필터링0.45 μm의 주사기 필터로 ution. 실온에서 1 시간 5% BSA / PBS 용액에 세포를 차단합니다.
1 % 안에 미리 정해진 농도 기본 항체를 (관심의 단백질에 대한 구체적인 희망되는) 희석 BSA / PBS (5 % BSA / PBS에서 희석하여 준비). 장소 parafilm 덮여 유리 접시에 기본 항체를 (25mm의 coverslip 30 μl, 18mm의 coverslip 당 20 μl, 12mm의 coverslip 당 15 μl) 희석. 세포가 다운 얼굴, 그리고 세포가 항체에 접촉되도록 항체 솔루션을 통해 그것을하다 이러한 반전, 고정 세포로 coverslip을 선택하십시오. 전체 구조를 통해 두 번째 parafilm 스트립를 놓습니다. 4 ° C 하룻밤에 품어.
3 일 : 세탁, 보조 항체 보육, 원자력 스테인 및 장착
- 조심스럽게 세포가 직면 있도록 최고 parafilm 스트립을 제거하고 coverslip을 받아 그것을 반전하고, 세척 각 우물에 PBS와 함께 접시에 돌려 놓으십시오.
- PBS로 세포를 3 번, 5 분 때마다 씻으십시오.
- , 기본 항체를 검출하는 기본 항체가 토끼로 만들어진 경우 예를 들어, 보조 항체는 토끼 IgG를 인식해야 보조 항체를 선택합니다. 또한 (IgG, IgM 등) 항체 isotype에 맞게 처리해. 여러 차 항체를 사용하는 경우, 그들은 서로 다른 종 또는 isotypes에서, 그리고 보조 항체에 연결된 다른 마커와 감지하는 계획을 확인하십시오. 예를 들어, 녹색 형광단에 방지 마우스 이차 결합과 빨간색 형광단에 방지 토끼 보조 결합을 사용할 수 있습니다. 기본과 동일한 기술을 사용하여 상온에서 어둠 속에서 2 시간 동안 1 % BSA에 적절한 농도로 희석 보조 항체 용액에 세포를 품어 (동영상에 표시되지 단계). 보조가 글리세롤 솔루션 (25mm의 coverslip 40 μl, 18mm의 coverslip 30 μl, 12mm의 coverslip 당 25 μl)으로 저장되는 경우 부화에 필요한 보조 항체의 볼륨 차 항체에 대한보다 약간 클 수 있습니다 .
- 참고 : 보조 항체를 시각화하는 형광 분자를 사용하는 경우 예제는 보조 항체가 추가되었습니다 일단 빛으로부터 보호되어야합니다. 어둠 속에서, 또는 호일 커버 플레이트에 품어.
- 참고 : 보조 항체를 시각화하는 형광 분자를 사용하는 경우 예제는 보조 항체가 추가되었습니다 일단 빛으로부터 보호되어야합니다. 어둠 속에서, 또는 호일 커버 플레이트에 품어.
- 조심스럽게로 기본 항체에 대한 설명 parafilm에서 coverslips를 제거합니다. 세포에게 2 μg / ML Hoechst 핵 PBS에 희석 얼룩 (핵 counterstain 선호하는 경우)에서 1 분 부화 다음 PBS로 2 회, 각 시간 5 분, 씻으십시오. 얼룩 Hoechst 오래된이고 신호가 너무 희미있다면, 배양 시간 및 / 또는 농도를 증가시킬 수 있습니다. Hoechst와 부화 후 5 분 PBS로 1 회 씻는다.
- coverslips는 현미경의 시각화를위한 설치 미디어와 슬라이드에 장착해야합니다. 형광 분자가 이차 항체의 시각화에 사용되는 경우에는 설치 미디어가 photobleaching 최소화하기 위해 에이전트를 포함해야합니다. 우리는 형광에 대한 설치 매체로 Vectashield를 사용합니다. 현미경 슬라이드 (25mm의 coverslip 당 12 μl, 18mm의 coverslip 당 6 μl, 12mm의 coverslip 당 3 μl)에 Vectashield의 적절한 크기 드롭를 놓습니다.
- 조심스럽게 coverslip을 선택하고 소금을 (PBS에서) 제거 탈이온수로 다시 씻어. kimwipe이나 종이 타월에 과도한 물에서 DAB하고 아래로 향하게 전지 Vectashield의 드롭에 누워. 각도에 coverslip을 놓고 트래핑 기포를 피하기 위해 천천히 내려 수 있습니다. 날짜 및 샘플 정보로 슬라이드를 라벨.
- coverslips와 슬라이드 coverslip 가장자리 주변에서 (어둠)을 초과하는 Vectashield에서 다음 흡입을 건조하도록 허용합니다. 원하는 경우 coverslip의 가장자리는 현재 (coverslips가 거꾸로 현미경에서 볼 수있는 경우 특히 유용합니다), 매니큐어와 봉인 수 있습니다. 우리는 일반적으로 -20 ° C의 냉장고에있는 슬라이드를 저장합니다.
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Discussion
이 프로토콜은 필요한 항체의 볼륨을 최소화하고 안정적인 세포 얼룩을 제공 hNSPCs위한 immunostaining 절차를 설명합니다. 설명된 절차는 세포내 항원 최선이지만, 세포 표면 분자를 얼룩이나 cytoskeleton의 얼룩을 향상시키기 위해 수정할 수 있습니다.
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Acknowledgments
저자는 어린이 병원 parafilm의 얼룩 기술의 초기 교육에 대해 에모리 대학에서 hNSPC 문화와 박사 게리 Bassell를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma-Aldrich | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher Scientific | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| H–chst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H.
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
