كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية
Summary
كيمياء سيتولوجية مناعية قوية هو وسيلة لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين أحد الأجسام المضادة للحفاظ على والحصول على أقصى استفادة من تلطيخ واحد.
Abstract
كيمياء سيتولوجية مناعية هو وسيلة قوية للغاية واضحة إلى حد ما لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة ، والأكثر شيوعا وهو بروتين في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين الباحثين للحفاظ على الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي في حين الحصول على الجودة العالية والنوعية والبيانات الكمية استنساخه من تلوين الخاصة بهم. هناك جانبان لهذا البروتوكول الذي يساعد على الحفاظ على حجم الأجسام المضادة اللازمة للتلوين. لأحد ، وتزرع الخلايا على coverslips الصغيرة الدائرية التي يتم وضعها في الآبار من نسيج لوحة الثقافة. بعد التثبيت ، يمكن إزالة الخلايا على coverslips من الآبار لوحة. لتلوين الأجسام المضادة ، هو مقلوب ساترة مع الخلايا على قطرة صغيرة من المحلول على الضد parafilm ومغطاة بقطعة الثاني من parafilm لمنع جفاف. باستخدام هذا الأسلوب ، وهناك حاجة فقط ~ 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل ساترة (أو عينة) ليكون الملون. يصف هذا البروتوكول immunostaining من الخلايا الجذعية البشرية / السلائف العصبي (hNSPCs) ، ولكن يمكن استخدامها لكثير من أنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
Discussion
يصف هذا البروتوكول إجراء immunostaining hNSPCs لأنه يقلل من حجم الأجسام المضادة الضرورية ويعطي موثوقة تلوين الخلية. الإجراء كما هو موضح هو أفضل لمستضدات الخلايا ، ولكن يمكن تعديلها لطخه جزيئات سطح الخلية أو لتعزيز تلطيخ من الهيكل الخلوي.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف الدكتور فيليب H. شوارتز من العصبية الوطنية الجذعية البشرية الموارد خلية في مستشفى للأطفال ، أورانج كاونتي معهد البحوث لتوفير hNSPC الثقافات والدكتور غاري Bassell في جامعة إيموري للتعليم الأولي في تقنية تلوين parafilm.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
