Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.
Abstract
Imunocitoquímica é um método muito poderoso e bastante simples para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse, geralmente uma proteína, em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de passos que vai permitir aos investigadores para conservar anticorpos primário e secundário ao obter alta qualidade, reprodutíveis e qualitativa de dados quantitativos de sua coloração. Há dois aspectos deste protocolo, que contribuirá para a conservação do volume de anticorpos necessário para a coloração. Por um lado, as células são cultivadas em pequenas, lamínulas circulares que são colocados em poços de uma placa de cultura de tecidos. Após a fixação, as células em lamínulas podem ser removidos dos poços da placa. Para a coloração de anticorpos, as lamelas com células é invertido em uma pequena gota de solução anticorpo em parafilme e é coberta com um segundo pedaço de parafilme para evitar a secagem. Usando este método, apenas ~ 25 ml de solução de anticorpo é necessária para cada lamela (ou amostra) a ser manchada. Este protocolo descreve imunocoloração de-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas pode ser usado para muitos outros tipos celulares.
Protocol
Dia 1: Células Preparando Lamelas de vidro alemão e Seeding Nota: lamínulas alemães são muitas vezes preferível para cultura primária de células-tronco neurais e neurônios. Nós usamos o protocolo de limpeza a seguir para melhorar a adesão celular e se espalhando. Lamínulas posição em um rack pequeno que permitirá o acesso líquido para ambos os lados da lamela. Primeiro, lamínulas incubar em Liquinox 1% por 10 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Certif…
Discussion
Este protocolo descreve um procedimento de imunomarcação para hNSPCs que minimiza o volume de anticorpos necessário e dá coloração celular confiável. O procedimento descrito é o melhor para os antígenos intracelulares, mas podem ser modificados para mancha moléculas de superfície celular ou para melhorar a coloração do citoesqueleto.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC e Dr. Gary Bassell da Universidade de Emory para a instrução inicial na técnica de coloração parafilme.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips
Tool
Carolina Biological Supply Company
WW-63-3029
12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent
Reagent
Sigma
Z273279
very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide
Reagent
Sigma
P7280
Laminin, natural mouse
Reagent
Invitrogen
23017-015
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate
Tool
Fisher
08-772-1
Triton X-100
Reagent
Fisher
BP151-500
very viscous
Paraformaldehyde
Reagent
Sigma
P6148
potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells.In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).