İmmünositokimya varlığı, hücre içi lokalizasyonu ve kültür hücreleri ilgi antijen göreceli bolluk belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol sunan, kolay takip serisi bir antikorlar korunması ve boyama en iyi şekilde almak için sağlayacak adımlar.
Abstract
İmmünositokimya olup olmadığının belirlenmesi için çok güçlü ve oldukça basit bir yöntemi, hücre içi lokalizasyonu ve faiz, en yaygın kültür hücrelerinde protein, antijen göreceli bolluk. Bu protokol sunan, kolay takip onların boyama, yüksek kalite, tekrarlanabilir nitel ve nicel veri alırken araştırmacılar primer ve sekonder antikorlar tasarrufu sağlayacak adımları bir dizi. Bu protokolün boyanması için gerekli antikor hacminin korunmasına yardımcı iki yönü vardır. Biri için, hücrelerin doku kültürü plaka kuyulara yerleştirilen küçük, yuvarlak lamelleri yetiştirilmektedir. Fiksasyon sonra, lamelleri hücreleri plaka kuyulardan silinebilir. Antikor boyama, hücre ile lamel parafilm antikor çözüm küçük bir damla üzerine ters ve parafilm kurumasını önlemek için ikinci bir parça ile kaplıdır. Bu yöntemi kullanarak, sadece antikor çözüm ~ 25 ul boyanmış her lamel (ya da örnek) için gereklidir. Bu protokol, insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) immün açıklar, ama birçok diğer hücre türleri için kullanılabilir.
Protocol
1. Gün: Alman Cam lameller hazırlanması ve Seeding Hücreler Not: Alman cam lamelleri genellikle kültür birincil sinir kök hücreleri ve nöronlar için tercih edilir. Biz hücre yapışması ve yayılmasını geliştirmek için aşağıdaki temizleme protokolünü kullanır. Lamel her iki taraf için sıvı erişim sağlayacaktır küçük bir raf pozisyon lamelleri. İlk olarak, 10 dakika boyunca% 1 Liquinox inkübe lamelleri, deiyonize su ile 3 yıkar. Sabun köpükleri kalı…
Discussion
Bu protokol, gerekli antikor hacmi en aza indirir ve güvenilir hücre boyama verir hNSPCs bir immün prosedürü anlatılmaktadır. Açıklandığı gibi işlem hücre içi antijenler için iyi, ama hücre yüzey molekülleri leke veya hücre iskeletinin boyama artırmak için modifiye edilebilir.
Acknowledgements
Yazarlar, Çocuk Hastanesi, Emory Üniversitesi'nde hNSPC kültürler ve Dr. Gary Bassell parafilm boyama tekniği ilk öğretim sağlamak için Orange County Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynak Dr. Philip H. Schwartz kabul etmek istiyorum.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips
Tool
Carolina Biological Supply Company
WW-63-3029
12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent
Reagent
Sigma
Z273279
very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide
Reagent
Sigma
P7280
Laminin, natural mouse
Reagent
Invitrogen
23017-015
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate
Tool
Fisher
08-772-1
Triton X-100
Reagent
Fisher
BP151-500
very viscous
Paraformaldehyde
Reagent
Sigma
P6148
potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells.In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).