免疫細胞：ヒト神経幹細胞
Summary
免疫細胞が存在、細胞内局在性、および培養細胞における目的の抗原の相対量を決定する強力な方法です。このプロトコルは1つの抗体を節約し、自分の染色を最大限に活用することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。
Abstract
免疫細胞は、最も一般的に存在を決定するための非常に強力で、かなり簡単な方法、細胞内局在、及び目的の抗原の相対量、培養細胞での蛋白質、である。このプロトコルは、それらの染色質の高い、再現性の定性的および定量的データを取得中に研究者が一次および二次抗体を節約することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。染色のために必要な抗体の量を節約するために役立つ、このプロトコルには2つの側面があります。一つは、細胞は組織培養プレートのウェルに配置されている小型の、円形のカバーグラス上で増殖されています。固定後、カバースリップ上の細胞は、プレートのウェルから除去することができます。抗体染色の場合は、セルとカバースリップをパラフィルム上に抗体溶液の小滴の上に反転し、乾燥を防ぐためパラフィルムの2番目の部分で覆われている。この方法を使用して、抗体溶液のだけ〜25μlの染色される各カバースリップ（またはサンプル）のために必要です。このプロトコルは、ヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の免疫染色について説明します、しかし他の多くの細胞型に使用することができます。
Protocol
Discussion
このプロトコルは、必要な抗体の量を最小限に抑え、信頼性の高い細胞の染色を与えるhNSPCsための免疫染色の手順を説明します。として説明する手順は、細胞内抗原に最適ですが、細胞表面分子を染色したり、細胞骨格の染色を高めるために変更することができます。
Acknowledgements
著者らは、小児病院、パラフィルムの染色技術で最初の命令のためにエモリー大学でhNSPC文化や博士ゲイリーBassellを提供するためのオレンジカウンティ研究所で国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツ氏に感謝します。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
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