Immunocytochemistry: मानव तंत्रिका स्टेम सेल
Summary
Immunocytochemistry उपस्थिति, subcellular स्थानीयकरण, और सभ्य कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम में सक्षम हो जाएगा कि एक एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए और एक धुंधला के सबसे अधिक से बाहर प्राप्त की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत
Abstract
Immunocytochemistry उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली और काफी सरल विधि, subcellular स्थानीयकरण, और ब्याज, सबसे अधिक संवर्धित कोशिकाओं में एक प्रोटीन के एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम है कि शोधकर्ताओं के संरक्षण के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी जबकि बाहर उनके धुंधला उच्च गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा हो रही है सक्षम हो जाएगा की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत इस प्रोटोकॉल के दो पहलुओं है कि धुंधला के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा के संरक्षण में मदद कर रहे हैं. एक के लिए, कोशिकाओं के छोटे, परिपत्र coverslips कि एक ऊतक संस्कृति की थाली के कुओं में रखा जाता है पर बड़े हो रहे हैं. निर्धारण के बाद, coverslips पर कक्षों प्लेट के कुओं से हटाया जा सकता है है. एंटीबॉडी धुंधला के लिए, कोशिकाओं के साथ coverslip parafilm पर एक एंटीबॉडी समाधान के छोटे ड्रॉप पर उलटा है और parafilm को सुखाने को रोकने का एक दूसरा टुकड़ा के साथ कवर किया जाता है. इस पद्धति का उपयोग करके, केवल ~ एंटीबॉडी समाधान के 25 μl प्रत्येक (या नमूना) coverslip के लिए दाग के लिए की जरूरत है. इस प्रोटोकॉल मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) के immunostaining का वर्णन है, लेकिन कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल hNSPCs कि एंटीबॉडी की मात्रा आवश्यक minimizes और विश्वसनीय सेल धुंधला देता है के लिए एक immunostaining प्रक्रिया का वर्णन. प्रक्रिया के रूप में वर्णित intracellular प्रतिजनों के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन कोशिका की सतह अणुओं द?…
Acknowledgements
लेखकों के लिए बच्चों के अस्पताल, Emory विश्वविद्यालय में parafilm धुंधला तकनीक में प्रारंभिक शिक्षा के लिए hNSPC संस्कृतियों और डॉ. गैरी Bassell प्रदान करने के लिए ऑरेंज काउंटी अनुसंधान संस्थान में राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन के डॉ. फिलिप एच. Schwartz स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
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- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
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