Summary

Immunocytochemistry: मानव तंत्रिका स्टेम सेल

Published: August 24, 2007
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Summary

Immunocytochemistry उपस्थिति, subcellular स्थानीयकरण, और सभ्य कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम में सक्षम हो जाएगा कि एक एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए और एक धुंधला के सबसे अधिक से बाहर प्राप्त की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत

Abstract

Immunocytochemistry उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली और काफी सरल विधि, subcellular स्थानीयकरण, और ब्याज, सबसे अधिक संवर्धित कोशिकाओं में एक प्रोटीन के एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम है कि शोधकर्ताओं के संरक्षण के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी जबकि बाहर उनके धुंधला उच्च गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा हो रही है सक्षम हो जाएगा की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत इस प्रोटोकॉल के दो पहलुओं है कि धुंधला के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा के संरक्षण में मदद कर रहे हैं. एक के लिए, कोशिकाओं के छोटे, परिपत्र coverslips कि एक ऊतक संस्कृति की थाली के कुओं में रखा जाता है पर बड़े हो रहे हैं. निर्धारण के बाद, coverslips पर कक्षों प्लेट के कुओं से हटाया जा सकता है है. एंटीबॉडी धुंधला के लिए, कोशिकाओं के साथ coverslip parafilm पर एक एंटीबॉडी समाधान के छोटे ड्रॉप पर उलटा है और parafilm को सुखाने को रोकने का एक दूसरा टुकड़ा के साथ कवर किया जाता है. इस पद्धति का उपयोग करके, केवल ~ एंटीबॉडी समाधान के 25 μl प्रत्येक (या नमूना) coverslip के लिए दाग के लिए की जरूरत है. इस प्रोटोकॉल मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) के immunostaining का वर्णन है, लेकिन कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

दिन 1: जर्मन ग्लास Coverslips तैयारी और सीडिंग कक्ष नोट: जर्मन कांच coverslips अक्सर संवर्धन प्राथमिक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के लिए बेहतर हैं . हम निम्नलिखित सफाई प्रोटोकॉल का उपयोग करने …

Discussion

इस प्रोटोकॉल hNSPCs कि एंटीबॉडी की मात्रा आवश्यक minimizes और विश्वसनीय सेल धुंधला देता है के लिए एक immunostaining प्रक्रिया का वर्णन. प्रक्रिया के रूप में वर्णित intracellular प्रतिजनों के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन कोशिका की सतह अणुओं द?…

Acknowledgements

लेखकों के लिए बच्चों के अस्पताल, Emory विश्वविद्यालय में parafilm धुंधला तकनीक में प्रारंभिक शिक्षा के लिए hNSPC संस्कृतियों और डॉ. गैरी Bassell प्रदान करने के लिए ऑरेंज काउंटी अनुसंधान संस्थान में राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन के डॉ. फिलिप एच. Schwartz स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips Tool Carolina Biological Supply Company WW-63-3029 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent Reagent Sigma Z273279 very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide Reagent Sigma P7280  
Laminin, natural mouse Reagent Invitrogen 23017-015  
EMEM (1X) Reagent Mediatech MT-10-010-CV Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate Tool Fisher 08-772-1  
Triton X-100 Reagent Fisher BP151-500 very viscous
Paraformaldehyde Reagent Sigma P6148 potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free Reagent Jackson Immunoresearch 001-000-161  
Hoechst 33342 Reagent Invitrogen H-1399  
Vectashield Reagent Vector Laboratories H-1000 viscous

References

  1. Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
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  5. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).

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Cite This Article
Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e267, doi:10.3791/267 (2007).

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