Immuncytokemi är en kraftfull metod för att bestämma närvaro, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa antal steg som gör det möjligt för en att bevara antikroppar och få ut det mesta av ens färgning.
Abstract
Immuncytokemi är en mycket kraftfull och ganska enkel metod för bestämning av förekomst, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse, oftast ett protein, i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa serie steg som gör det möjligt för forskare att bevara primära och sekundära antikroppar samtidigt få hög kvalitet, reproducerbar kvalitativa och kvantitativa data ur sin färgning. Det finns två aspekter av detta protokoll som bidrar till att bevara volym antikroppar som behövs för färgning. För en, är de celler som odlas på små, runda täckglas som placeras i brunnar i en vävnadskultur tallrik. Efter fixering kan cellerna täckglasen tas bort från brunnar i plattan. För antikroppar färgning är täckglas med celler inverterad på en liten droppe antikropp lösning på parafilm och är täckt med en andra bit parafilm att förhindra uttorkning. Med denna metod är endast ~ 25 ìl av antikroppar lösning som krävs för varje täckglas (eller prov) för att färgas. Detta protokoll beskriver immunfärgning av mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), men kan användas till många andra celltyper.
Protocol
Dag 1: Förbereda tyska Glas Täckglas och såmaskiner celler OBS: Tyska glas täckglas är ofta att föredra för odling primära neurala stamceller och nervceller. Vi använder följande rengörings-protokollet för att förbättra cell adhesion och spridning. Placera täckglas i en liten rack som gör att vätskan tillgång till båda sidor av täckglas. Först inkubera täckglas i 1% Liquinox i 10 minuter, följt av tre tvättar med avjoniserat vatten. Se till att inga såpbubblor…
Discussion
Detta protokoll beskriver en immunfärgning förfarande för hNSPCs som minimerar volym antikroppar som behövs och ger pålitlig cellfärgning. Förfarandet som beskrivs är bäst för intracellulära antigener, men kan modifieras för att färga molekyler på cellens yta eller för att förbättra färgning av cytoskelettet.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs vid barnsjukhuset i Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPC kulturer och Dr Gary Bassell vid Emory University för inledande undervisning i parafilm målningsteknik.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips
Tool
Carolina Biological Supply Company
WW-63-3029
12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent
Reagent
Sigma
Z273279
very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide
Reagent
Sigma
P7280
Laminin, natural mouse
Reagent
Invitrogen
23017-015
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate
Tool
Fisher
08-772-1
Triton X-100
Reagent
Fisher
BP151-500
very viscous
Paraformaldehyde
Reagent
Sigma
P6148
potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells.In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).