Summary

Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Published: August 24, 2007
doi:

Summary

Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.

Abstract

Immunzytochemie ist eine sehr mächtige und ziemlich einfache Methode zur Bestimmung der Gegenwart, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse, am häufigsten ein Protein, in kultivierten Zellen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, ermöglichen es Forschern, primäre und sekundäre Antikörper zu erhalten, während sich hohe Qualität, reproduzierbare qualitative und quantitative Daten aus ihrer Färbung wird. Es gibt zwei Aspekte dieses Protokoll, um die Lautstärke des Antikörpers notwendig für die Färbung sparen helfen. Zum einen werden die Zellen auf kleine, runde Deckgläser, dass in Vertiefungen einer Gewebekultur Platte gelegt angebaut werden. Nach der Fixierung können die Zellen auf Deckgläsern aus den Vertiefungen der Platte entfernt werden. Für Antikörper-Färbung wird das Deckglas mit Zellen auf einen kleinen Tropfen Antikörperlösung auf Parafilm invertiert und ist mit einem zweiten Stück Parafilm Austrocknen zu verhindern abgedeckt. Mit dieser Methode ist nur ~ 25 ul Antikörper-Lösung für jedes Deckglas (oder Muster) zu gebeizt werden musste. Dieses Protokoll beschreibt Immunfärbung der menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), kann aber auch für viele andere Zelltypen verwendet werden.

Protocol

Tag 1: Vorbereiten deutschen Deckgläser und Seeding Cells Hinweis: Deutsch Deckgläser sind oft besser zur Kultivierung von primären neuralen Stammzellen und Neuronen. Wir verwenden die folgenden Reinigungs-Protokoll, um die Zelladhäsion und Verbreitung zu verbessern. Position Deckgläser in einem kleinen Gestell, das flüssige Zugang zu beiden Seiten des Deckglases ermöglicht. Zunächst inkubieren Deckgläser in 1% Liquinox für 10 Minuten, gefolgt von 3 Waschschritten mit deioni…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Immunfärbung Verfahren für hNSPCs dass das Volumen des Antikörpers notwendig minimiert und verleiht zuverlässige Zellfärbung. Das beschriebene Verfahren ist am besten für die intrazelluläre Antigene, kann aber geändert werden, um Zelloberflächenmoleküle Flecken oder Verfärbungen des Zytoskeletts zu verbessern.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen an der Kinderklinik, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen und Dr. Gary Bassell an der Emory University für den Anfangsunterricht in der Parafilm Maltechnik anzuerkennen.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips Tool Carolina Biological Supply Company WW-63-3029 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent Reagent Sigma Z273279 very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide Reagent Sigma P7280  
Laminin, natural mouse Reagent Invitrogen 23017-015  
EMEM (1X) Reagent Mediatech MT-10-010-CV Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate Tool Fisher 08-772-1  
Triton X-100 Reagent Fisher BP151-500 very viscous
Paraformaldehyde Reagent Sigma P6148 potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free Reagent Jackson Immunoresearch 001-000-161  
Hoechst 33342 Reagent Invitrogen H-1399  
Vectashield Reagent Vector Laboratories H-1000 viscous

References

  1. Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
  2. Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
  3. Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
  4. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
  5. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).

Play Video

Cite This Article
Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e267, doi:10.3791/267 (2007).

View Video