Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells
Summary
Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.
Abstract
Immunzytochemie ist eine sehr mächtige und ziemlich einfache Methode zur Bestimmung der Gegenwart, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse, am häufigsten ein Protein, in kultivierten Zellen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, ermöglichen es Forschern, primäre und sekundäre Antikörper zu erhalten, während sich hohe Qualität, reproduzierbare qualitative und quantitative Daten aus ihrer Färbung wird. Es gibt zwei Aspekte dieses Protokoll, um die Lautstärke des Antikörpers notwendig für die Färbung sparen helfen. Zum einen werden die Zellen auf kleine, runde Deckgläser, dass in Vertiefungen einer Gewebekultur Platte gelegt angebaut werden. Nach der Fixierung können die Zellen auf Deckgläsern aus den Vertiefungen der Platte entfernt werden. Für Antikörper-Färbung wird das Deckglas mit Zellen auf einen kleinen Tropfen Antikörperlösung auf Parafilm invertiert und ist mit einem zweiten Stück Parafilm Austrocknen zu verhindern abgedeckt. Mit dieser Methode ist nur ~ 25 ul Antikörper-Lösung für jedes Deckglas (oder Muster) zu gebeizt werden musste. Dieses Protokoll beschreibt Immunfärbung der menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), kann aber auch für viele andere Zelltypen verwendet werden.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Immunfärbung Verfahren für hNSPCs dass das Volumen des Antikörpers notwendig minimiert und verleiht zuverlässige Zellfärbung. Das beschriebene Verfahren ist am besten für die intrazelluläre Antigene, kann aber geändert werden, um Zelloberflächenmoleküle Flecken oder Verfärbungen des Zytoskeletts zu verbessern.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen an der Kinderklinik, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen und Dr. Gary Bassell an der Emory University für den Anfangsunterricht in der Parafilm Maltechnik anzuerkennen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
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