İmmünositokimya: İnsan Sinir Kök Hücreler
Summary
İmmünositokimya varlığı, hücre içi lokalizasyonu ve kültür hücreleri ilgi antijen göreceli bolluk belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol sunan, kolay takip serisi bir antikorlar korunması ve boyama en iyi şekilde almak için sağlayacak adımlar.
Abstract
İmmünositokimya olup olmadığının belirlenmesi için çok güçlü ve oldukça basit bir yöntemi, hücre içi lokalizasyonu ve faiz, en yaygın kültür hücrelerinde protein, antijen göreceli bolluk. Bu protokol sunan, kolay takip onların boyama, yüksek kalite, tekrarlanabilir nitel ve nicel veri alırken araştırmacılar primer ve sekonder antikorlar tasarrufu sağlayacak adımları bir dizi. Bu protokolün boyanması için gerekli antikor hacminin korunmasına yardımcı iki yönü vardır. Biri için, hücrelerin doku kültürü plaka kuyulara yerleştirilen küçük, yuvarlak lamelleri yetiştirilmektedir. Fiksasyon sonra, lamelleri hücreleri plaka kuyulardan silinebilir. Antikor boyama, hücre ile lamel parafilm antikor çözüm küçük bir damla üzerine ters ve parafilm kurumasını önlemek için ikinci bir parça ile kaplıdır. Bu yöntemi kullanarak, sadece antikor çözüm ~ 25 ul boyanmış her lamel (ya da örnek) için gereklidir. Bu protokol, insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) immün açıklar, ama birçok diğer hücre türleri için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Bu protokol, gerekli antikor hacmi en aza indirir ve güvenilir hücre boyama verir hNSPCs bir immün prosedürü anlatılmaktadır. Açıklandığı gibi işlem hücre içi antijenler için iyi, ama hücre yüzey molekülleri leke veya hücre iskeletinin boyama artırmak için modifiye edilebilir.
Acknowledgements
Yazarlar, Çocuk Hastanesi, Emory Üniversitesi'nde hNSPC kültürler ve Dr. Gary Bassell parafilm boyama tekniği ilk öğretim sağlamak için Orange County Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynak Dr. Philip H. Schwartz kabul etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
