Immunocitochimica: cellule staminali neuronali
Summary
Immunocitochimica è un potente metodo per determinare la presenza, localizzazione subcellulare e l'abbondanza relativa di un antigene di interesse in cellule in coltura. Questo protocollo presenta un facile da seguire serie di passaggi che permettono di conservare gli anticorpi e ottenere il massimo della propria colorazione.
Abstract
Immunocitochimica è un metodo molto potente e molto semplice per la determinazione della presenza, localizzazione subcellulare e l'abbondanza relativa di un antigene di interesse, più comunemente una proteina, in cellule in coltura. Questo protocollo presenta un facile da seguire serie di passi che permetterà ai ricercatori di conservare gli anticorpi primari e secondari mentre ottenere alta qualità, qualità riproducibile e dati quantitativi dalla loro colorazione. Ci sono due aspetti di questo protocollo che consente di preservare il volume di anticorpi necessari per la colorazione. Per uno, le cellule sono coltivate su piccole lamelle circolari che sono posti in pozzetti di una piastra di coltura dei tessuti. Dopo la fissazione, le cellule su vetrini possono essere rimossi dai pozzetti della piastra. Per la colorazione degli anticorpi, il vetrino con le cellule è invertita su una piccola goccia di soluzione di anticorpi su parafilm ed è coperto con un secondo pezzo di parafilm per evitare l'essiccazione. Utilizzando questo metodo, solo ~ 25 ml di soluzione di anticorpi è necessario per ogni coprioggetto (o campione) per essere colorato. Questo protocollo descrive immunocolorazione di staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs), ma può essere usato per molti altri tipi di cellule.
Protocol
Discussion
Questo protocollo descrive una procedura per immunocolorazione hNSPCs che riduce al minimo il volume di anticorpi necessari e dà colorazione affidabile cellulare. La procedura descritta è meglio per gli antigeni intracellulari, ma può essere modificato per macchiare le molecole della superficie cellulare o per migliorare la colorazione del citoscheletro.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di culture hNSPC e il Dr. Gary Bassell alla Emory University per l'istruzione iniziale nella tecnica di colorazione parafilm.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
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