Summary

Immuncytokemi: Mänskliga neurala stamceller

Published: August 24, 2007
doi:

Summary

Immuncytokemi är en kraftfull metod för att bestämma närvaro, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa antal steg som gör det möjligt för en att bevara antikroppar och få ut det mesta av ens färgning.

Abstract

Immuncytokemi är en mycket kraftfull och ganska enkel metod för bestämning av förekomst, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse, oftast ett protein, i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa serie steg som gör det möjligt för forskare att bevara primära och sekundära antikroppar samtidigt få hög kvalitet, reproducerbar kvalitativa och kvantitativa data ur sin färgning. Det finns två aspekter av detta protokoll som bidrar till att bevara volym antikroppar som behövs för färgning. För en, är de celler som odlas på små, runda täckglas som placeras i brunnar i en vävnadskultur tallrik. Efter fixering kan cellerna täckglasen tas bort från brunnar i plattan. För antikroppar färgning är täckglas med celler inverterad på en liten droppe antikropp lösning på parafilm och är täckt med en andra bit parafilm att förhindra uttorkning. Med denna metod är endast ~ 25 ìl av antikroppar lösning som krävs för varje täckglas (eller prov) för att färgas. Detta protokoll beskriver immunfärgning av mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), men kan användas till många andra celltyper.

Protocol

Dag 1: Förbereda tyska Glas Täckglas och såmaskiner celler OBS: Tyska glas täckglas är ofta att föredra för odling primära neurala stamceller och nervceller. Vi använder följande rengörings-protokollet för att förbättra cell adhesion och spridning. Placera täckglas i en liten rack som gör att vätskan tillgång till båda sidor av täckglas. Först inkubera täckglas i 1% Liquinox i 10 minuter, följt av tre tvättar med avjoniserat vatten. Se till att inga såpbubblor…

Discussion

Detta protokoll beskriver en immunfärgning förfarande för hNSPCs som minimerar volym antikroppar som behövs och ger pålitlig cellfärgning. Förfarandet som beskrivs är bäst för intracellulära antigener, men kan modifieras för att färga molekyler på cellens yta eller för att förbättra färgning av cytoskelettet.

Acknowledgements

Författarna vill tacka för Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs vid barnsjukhuset i Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPC kulturer och Dr Gary Bassell vid Emory University för inledande undervisning i parafilm målningsteknik.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips Tool Carolina Biological Supply Company WW-63-3029 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent Reagent Sigma Z273279 very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide Reagent Sigma P7280  
Laminin, natural mouse Reagent Invitrogen 23017-015  
EMEM (1X) Reagent Mediatech MT-10-010-CV Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate Tool Fisher 08-772-1  
Triton X-100 Reagent Fisher BP151-500 very viscous
Paraformaldehyde Reagent Sigma P6148 potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free Reagent Jackson Immunoresearch 001-000-161  
Hoechst 33342 Reagent Invitrogen H-1399  
Vectashield Reagent Vector Laboratories H-1000 viscous

References

  1. Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
  2. Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
  3. Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
  4. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
  5. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).

Play Video

Cite This Article
Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e267, doi:10.3791/267 (2007).

View Video