Immuncytokemi: Mänskliga neurala stamceller

Summary

Immuncytokemi är en kraftfull metod för att bestämma närvaro, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa antal steg som gör det möjligt för en att bevara antikroppar och få ut det mesta av ens färgning.

Abstract

Immuncytokemi är en mycket kraftfull och ganska enkel metod för bestämning av förekomst, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse, oftast ett protein, i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa serie steg som gör det möjligt för forskare att bevara primära och sekundära antikroppar samtidigt få hög kvalitet, reproducerbar kvalitativa och kvantitativa data ur sin färgning. Det finns två aspekter av detta protokoll som bidrar till att bevara volym antikroppar som behövs för färgning. För en, är de celler som odlas på små, runda täckglas som placeras i brunnar i en vävnadskultur tallrik. Efter fixering kan cellerna täckglasen tas bort från brunnar i plattan. För antikroppar färgning är täckglas med celler inverterad på en liten droppe antikropp lösning på parafilm och är täckt med en andra bit parafilm att förhindra uttorkning. Med denna metod är endast ~ 25 ìl av antikroppar lösning som krävs för varje täckglas (eller prov) för att färgas. Detta protokoll beskriver immunfärgning av mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), men kan användas till många andra celltyper.

Protocol

Dag 1: Förbereda tyska Glas Täckglas och såmaskiner celler OBS: Tyska glas täckglas är ofta att föredra för odling primära neurala stamceller och nervceller. Vi använder följande rengörings-protokollet för att förbättra cell adhesion och spridning. Placera täckglas i en liten rack som gör att vätskan tillgång till båda sidor av täckglas. Först inkubera täckglas i 1% Liquinox i 10 minuter, följt av tre tvättar med avjoniserat vatten. Se till att inga såpbubblor…

Discussion

Detta protokoll beskriver en immunfärgning förfarande för hNSPCs som minimerar volym antikroppar som behövs och ger pålitlig cellfärgning. Förfarandet som beskrivs är bäst för intracellulära antigener, men kan modifieras för att färga molekyler på cellens yta eller för att förbättra färgning av cytoskelettet.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological Supply Company	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson Immunoresearch	001-000-161
Hoechst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous