Summary
सीमित कमजोर पड़ने कोशिका प्रत्यारोपण assays ट्यूमर कोशिकाओं प्रचार की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए किया जाता है. इस प्रोटोकॉल syngeneic zebrafish कि fluorescently लेबल लेकिमिया और विवरण कैसे अलग है और वयस्क zebrafish की peritoneal गुहा में सीमित कमजोर पड़ने पर इन लेकिमिया कोशिकाओं के प्रत्यारोपण विकसित पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Protocol
1. Zebrafish भ्रूण की डीएनए microinjection
- Rag2 Linearize: GFP 11 डीएनए constructs: cMyc और rag2: 37 ° रातोंरात सी चना के साथ प्रत्येक प्लाज्मिड 10μg पचाने द्वारा.
- Phenol: क्लोरोफॉर्म निकालने और plasmids वेग, और प्रत्येक 20μL एच 2 ओ resuspend
- 10μL 20μL, और एक डीएनए सीढ़ी उच्च श्रेणी के 5μL के साथ एक 1% agarose जेल पर प्रत्येक पचा प्लाज्मिड के 1:01, 1:05, 1:10 और कमजोर पड़ने चलाकर डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. मात्रा का ठहराव के इस प्रकार का आमतौर पर एक स्पेक्ट्रोमीटर पढ़ने से अधिक सटीक है.
- 1M KCl 0.5 एक्स ते में 60ng/μL के अंतिम इंजेक्शन के लिए एकाग्रता CG1 तनाव (या अन्य syngeneic तनाव) में डीएनए पतला zebrafish भ्रूण का उपयोग rag2 30ng/μL: cMyc + rag2 30ng/μL: GFP.
- इंजेक्शन 12 पहले दिखा दिया, 13 के रूप में किया जाना चाहिए. संक्षेप में, पुरुष और महिला zebrafish संभोग कक्षों में इंजेक्शन से पहले रात सेट कर रहे हैं. इंजेक्शन के दिन, डीएनए इंजेक्शन सुई में भरी हुई है, दबाव इतना समायोजित किया जाता है कि एक 50μm व्यास के साथ एक बुलबुला (30pg डीएनए) निष्कासित कर दिया है, जो एक मंच सुक्ष्ममापी द्वारा मापा जाता है. फिर, भ्रूण एक सेल चरण में इंजेक्ट कर रहे हैं डीएनए सेल में सीधे इंजेक्शन जा रहा है, जर्दी में नहीं है और. इंजेक्शन CG1 भ्रूण और लार्वा के जीवन रक्षा आम तौर पर गरीब है, और मछली का केवल 5% सफलतापूर्वक transgene को शामिल करेंगे, इस प्रकार,> 600 भ्रूण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कुछ मछली लेकिमिया विकसित होगा इंजेक्शन होना चाहिए.
- 28.5 ° C में इंजेक्शन भ्रूण स्टोर, और 24 घंटे बाद मृत भ्रूण को निकालने के. पशु हैं तो जीवन के 5 दिनों के में बड़े टैंक स्थानांतरित और उठाया के रूप में पहले 14 में वर्णित है .
2. Zebrafish लार्वा में प्राथमिक सभी टी के लिए स्क्रीनिंग
- इंजेक्शन के बाद लगभग 28 दिन, 25ml मछली प्रणाली पानी की एक पेट्री डिश में / 4ng मीटर Tricane - एस के 200μL जोड़कर लार्वा zebrafish anesthetize.
- टी सभी 20X बढ़ाई epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, 485/20 उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 530/25 GFP प्रतिदीप्ति (चित्रा 1) का पता लगाने के लिए फिल्टर उत्सर्जन का उपयोग करके fluorescently लेबल के विकास के लिए लार्वा की जांच करना.
- उन है कि नकारात्मक से अलग ट्यूमर सकारात्मक लार्वा. नकारात्मक लार्वा एक बाद में समय बिंदु पर जांच किया जा सकता है है, एक बार ट्यूमर बड़ा हो हो सकता है, सुनिश्चित करें कि कोई टी सभी सकारात्मक मछली चूक गए थे.
- मॉनिटर टी सभी सप्ताह में सकारात्मक कम से कम एक बार मछली epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग ट्यूमर के विकास को ट्रैक करने के लिए.
3. और fluorescently लेबल प्राथमिक लेकिमिया कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि
- जब GFP पॉजिटिव लेकिमिया कोशिकाओं> पशु का 50% पीछे छोड़ दिया है, 9mL मछली प्रणाली पानी युक्त एक पेट्री डिश में Tricane - एस 4ng/mL के 1ml जोड़कर मछली बलिदान.
- एक नए पेट्री डिश में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ 1ml 0.9X पीबीएस युक्त कोशिकाओं बफर मछली रखें. एक रेजर ब्लेड, pipet बड़े सेल clumps अलग कर देना करने के लिए मिश्रण के साथ मछली पानी में डालकर रखना है, तो एक 50ml ट्यूब में एक 40μm जाल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं. यह एकल कक्षों में सभी ऊतक clumps अलग कर देना आवश्यक नहीं है.
- कक्षों की एक 4mL polystyrene ट्यूब Pipet 500μL. 1μL 1mg/mL propidium आयोडाइड (PI) है, जो मृत कोशिकाओं लेबल जोड़ें. भंवर, तो बर्फ पर कक्षों रखने के.
- एक जंगली प्रकार CG1 मछली बलिदान, सिझाना और एक ही रास्ते में तनाव के ऊपर के रूप में 0.9X पीबीएस में transplant.Add 4mL 5% FBS के दौरान सामान्य कोशिकाओं है, जो ट्यूमर कोशिकाओं के लिए एक वाहक के रूप में सेवा करते हैं इकट्ठा करने के लिए कुल के लिए 50ml ट्यूब 5ml की मात्रा.
- 5% FBS में सामान्य कोशिकाओं, पतला करने के लिए 3x10 5 कोशिकाओं / एमएल 0.9X पीबीएस में गणना करें तो एक 96 अच्छी तरह से थाली के pipet 100μL/well.
- 96 अच्छी तरह से निम्नलिखित खुराक पर रक्त कोशिकाओं से युक्त थाली में एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) सॉर्टर, सॉर्ट सकारात्मक GFP, PI नकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं (चित्र 2A, बी) का प्रयोग: 10 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 48 कुओं, 100 कोशिकाओं / अच्छी तरह से में / / 24 कुओं, 1000 कोशिकाओं में अच्छी तरह से 12 कुओं और 10,000 कोशिकाओं में अच्छी तरह से 6 कुओं में. इसके अतिरिक्त, १०,००० कोशिकाओं के सामान्य रक्त कोशिकाओं के बिना एक अच्छी तरह से में हल किया जाना चाहिए, और reanalyzed FACS का उपयोग करने के लिए पवित्रता और सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की व्यवहार्यता (चित्रा 2C) का आकलन है.
4. वयस्क zebrafish में कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण सीमित
- गोली 2000xg पर 10 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली centrifuging द्वारा कोशिकाओं.
- सतह पर तैरनेवाला के 95μL निकालें, और शेष 5μL में कोशिकाओं resuspend.
- एक वयस्क (> 60 दिन पुरानी) syngeneic zebrafish ventral पक्ष पकड़ो ऊपर, और peritoneal गुहा में इंजेक्षन सेल निलंबन, एक 26G / 2 "माइक्रो - सिरिंज का उपयोग कर. Zebrafish के प्रत्यारोपण से पहले anesthetized हो नहीं है. आमतौर पर, 45 मछली 10 लेकिमिया कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं, 20 100 कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं, 7 1,000 कोशिकाओं और 5 मछली के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं टी १०००० सभी कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं.
5. लेकिमिया की शुरुआत सेल आवृत्ति निर्धारित विश्लेषण
- लगभग 28 दिनों के प्रत्यारोपण के बाद, एक epifluoresence 485/20 उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 530/25 उत्सर्जन GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने फिल्टर का उपयोग कर खुर्दबीन के साथ प्रतिरोपित मछली की जांच. इंजेक्शन मछली की कुल संख्या प्रति सकारात्मक मछली की संख्या रिकार्ड.
- पुनः मछली की जांच के लिए 90 दिनों के लिए हर 14 दिन और सकारात्मक मछली की संख्या में रिकॉर्ड. जब एक ट्यूमर सकारात्मक मछली मरणासन्न बन अधिक मात्रा Tricane - एस के द्वारा पशु बलि.
- इनपुट एक तालिका में परिणाम के रूप में चित्रा 3 डी में दिखाया गया है. वेब आधारित (कमजोर पड़ने विश्लेषण सीमित चरम) पर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर Elda में डेटा अपलोड http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 15, जो ट्यूमर सकारात्मक और नकारात्मक जानवरों की आवृत्ति का उपयोग करता है प्रत्येक प्रत्यारोपण प्राथमिक टी सभी के भीतर स्वयं renewing लेकिमिया कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित खुराक.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
Syngeneic मछली से भ्रूण में डीएनए microinjection अक्सर इंजेक्शन भ्रूण के एक कम जीवित रहने की दर में <60% भ्रूण के 24 घंटे के लिए जीवित रहने के साथ, परिणाम है. इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन syngeneic मछली के अस्तित्व लार्वा विकास के दौरान आम तौर पर गरीब है, अक्सर के साथ <20% 28 दिनों के लिए जीवित. इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण की एक बड़ी संख्या इंजेक्षन ट्रांसजेनिक मछली है कि टी सभी विकसित करना होगा बनाने के क्रम में.
एक उदाहरण के रूप में, CG1 तनाव भ्रूण rag2 के साथ अंतःक्षिप्त थे: cMyc + rag2: GFP. transgenes विकासशील भ्रूण में सह - अलग है, इसलिए है कि हर कोशिका है कि GFP व्यक्त भी cMyc व्यक्त करेंगे. लार्वा के बाद 28 दिनों (चित्रा 1) टी सभी के लिए प्राथमिक जांच की गई. पिछले काम दिखाया गया है कि इंजेक्शन मछली के लगभग 5% उनके thymus के भीतर टी कोशिकाओं GFP पॉजिटिव (चित्रा 1) होगा, और इन मछलियों की 100% लेकिमिया विकसित टी कोशिकाओं के रूप में 11 बदल एक हो जाते हैं. जबकि zebrafish के एक छोटे से अनुपात एक और अधिक उन्नत लेकिमिया है कि 28 दिन में पता लगाने के बहुत आसान है हो सकता है, अधिकांश केवल एक GFP सकारात्मक thymus (चित्रा 1) होगा, इतना लार्वा उच्च वृद्धि के तहत व्यक्तिगत जांच चाहिए सुनिश्चित करें कि सभी सकारात्मक मछली का चयन कर रहे हैं. टी सभी GFP पॉजिटिव कोशिकाओं> 45-70 दिनों के बीच जानवर की 50% से आगे निकल जाएगा.
दिए गए उदाहरण में, zebrafish जीवन के 65 दिनों के में बलिदान थे, और लेकिमिया कोशिकाओं को अलग किया गया और FACS कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण सीमित करने के लिए हल. सिंगल कोशिकाओं है कि propidium आयोडाइड नकारात्मक और GFP पॉजिटिव (चित्रा 2) एक 96 - अच्छी तरह से थाली में हल किया गया. पुनर्विश्लेषण 10,000 सॉर्ट किया गया कोशिकाओं पर क्रम में करने के लिए व्यवहार्यता (आदर्श> 95%) और पवित्रता का आकलन किया गया था (आदर्श> 92%, चित्रा 2). प्रतिरोपित टी-alls आम तौर पर 28 दिन पहले उठता है, लेकिन कुछ ट्यूमर से अधिक 60 दिनों के लेने के लिए विकसित हो सकता है. इस उदाहरण में, 28 दिन में, प्रारंभिक चरण ट्यूमर इंजेक्शन साइट (3B चित्रा) के पास GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के एक क्षेत्र के रूप में देखा गया था, जबकि कुछ टी alls अधिक प्रगति थे, peritoneal गुहा (चित्रा 3C) भरने का विस्तार करने के लिए . तीन अलग - अलग प्राथमिक टी alls से कमजोर पड़ने कोशिका प्रत्यारोपण assays सीमित करने से डेटा चित्रा 3 डी में दिखाए जाते हैं. इन प्रयोगों के लिए, 220 से अधिक पशुओं को प्रतिरोपित थे, जो आसानी से कई घंटे के भीतर एक व्यक्ति द्वारा पूरा किया जा सकता है. Elda सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण से पता चला है कि, औसतन, 135 में 1 टी सभी कोशिकाओं स्वयं renewing लेकिमिया प्रचार कोशिकाओं (3E चित्रा) थे.
चित्रा 1 Zebrafish लार्वा एक सेल चीर के साथ मंच पर इंजेक्शन:: cMyc चीर +: - EGFP प्राथमिक लेकिमिया के विकास के लिए जांच की गई 28 दिनों के बाद इंजेक्शन. मछली (*) thymus में टी कोशिकाओं GFP-सकारात्मक था, इस मछली टी सभी के रूप में विकसित टी कोशिकाओं समय पर तब्दील हो जाएगा. इस चरण में 28 दिन में बहुत आम है. एक मछली (**) एक उन्नत था टी सब है कि मुलायम ऊतकों में फैल गया है. शेष दो मछली ट्यूमर के विकास के लिए नकारात्मक हैं. छवि 16X आवर्धन पर लिया गया था.
चित्रा 2. Fluorescently लेबल टी सभी कोशिकाओं को रोगग्रस्त पशुओं से हल किया गया है और सीमित कमजोर पड़ने कोशिका प्रत्यारोपण परख में इस्तेमाल किया. सबसे पहले, एक गेट के लिए एकल कक्षों (ऊपरी बाएँ पैनल) का चयन करने के लिए तैयार की गई थी, तो propidium आयोडाइड नकारात्मक कोशिकाओं (मध्यम बाईं पैनल) का चयन कर रहे हैं. अंत में, एक गेट केवल GFP सकारात्मक सॉर्टिंग के लिए लेकिमिया कोशिकाओं (निचले बाएं पैनल) का चयन करने के लिए तैयार किया गया था. क्रमबद्ध करें कोशिकाओं reanalyzed व्यवहार्यता और प्रत्यारोपण से पहले पवित्रता (सही पैनल) का आकलन करना चाहिए.
चित्रा 3. Zebrafish लेकिमिया के विकास के लिए 28 दिनों के प्रत्यारोपण के बाद जांच की गई. मछली या तो ट्यूमर negative (ए), एक छोटा सा इंजेक्शन साइट (बी) में बढ़ ट्यूमर है, या एक प्रगति ल्यूकेमिया (सी) है. छवियों 7X बढ़ाई पर ले जाया गया. प्रत्येक कमजोर पड़ने पर प्रत्यारोपित मछली की कुल संख्या प्रति ल्यूकेमिया पॉजिटिव मछली की कुल संख्या, (डी) के रूप में दर्ज है. डेटा को वेब आधारित Elda कार्यक्रम में इनपुट की संख्या की गणना कर रहे हैं स्वयं renewing लेकिमिया कोशिकाओं और ऊपरी और निचले 95% विश्वास अंतराल (ई).
Discussion
कैंसर अनुसंधान में zebrafish का उपयोग कर के एक प्रमुख शक्ति है कि पशुओं की बड़ी संख्या अपेक्षाकृत कम लागत पर इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कमजोर पड़ने कोशिका प्रत्यारोपण assays, जहां प्रतिरोपित जानवरों है कि प्रतिरोपित कुल संख्या के लिए ट्यूमर के विकास के अनुपात को ट्यूमर की शुरुआत सेल आवृत्ति निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है को सीमित करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यहाँ प्रस्तुत विधि में, 70 से अधिक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता जानवरों परख के प्रति इस्तेमाल किया जाता है, ट्यूमर प्रचार सेल संख्या का सही अनुमान प्रदान. दोनों इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या और ट्यूमर प्रतिरोपित कोशिकाओं की खुराक दी कैंसर के मॉडल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, अगर प्रारंभिक प्रयोगों चलता है कि ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं दुर्लभ हैं, उपयोगी प्रत्यारोपण खुराक 100,000, १०,०००, 50,000 और 1000 प्रति कोशिकाओं किया जा सकता है प्रत्यारोपण.
Syngeneic zebrafish उपभेदों कमजोर पड़ने विश्लेषण को सीमित करने में उपयोगी होते हैं. हालांकि, इन उपभेदों अभी तक आमतौर पर सभी प्रयोगशालाओं में प्रयोग नहीं किया हैं, और कुछ zebrafish कैंसर मॉडल केवल allogenic मछली में मौजूद है. सीमित कमजोर पड़ने सेल प्रत्यारोपण कि प्रतिरक्षा पृथक आया है जंगली प्रकार उपभेदों में प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि सेल स्वयं renewing आवृत्ति 1-10 गुना की तुलना में अगर syngeneic zebrafish 8 इस्तेमाल किया गया अधिक के रूप में गणना की जा सकती है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि कक्षों की अधिक खुराक गैर प्रतिरक्षा मिलान विकिरणित प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि कुछ ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के एक विदेशी microenvironment में नहीं बच जाएगा. इसके अतिरिक्त, कई ट्यूमर जब प्राप्तकर्ता जानवर प्रतिरक्षा प्रणाली ठीक 21 दिन बाद निकासी शुरू करने के लिए, तो जानवरों के हर 7 दिनों के प्रत्यारोपण के बाद ट्यूमर के विकास के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
यहाँ प्रस्तुत विधियों के किसी भी zebrafish कैंसर के मॉडल के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं, और इस प्रकार अब तक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ट्यूमर दोनों टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक 8 लेकिमिया, और एक ठोस ट्यूमर मॉडल, 16 rhabdomyosarcoma में सेल आवृत्ति की शुरुआत. ये ट्यूमर fluorescently दोनों एक ओंकोजीन और फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ भ्रूण के सह इंजेक्शन द्वारा लेबल थे, क्योंकि डीएनए सह - segregates, किसी भी सेल व्यक्त ओंकोजीन भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 17 व्यक्त करेंगे . जबकि प्रतिदीप्ति की सिफारिश की है क्योंकि यह पशु बलि के लिए की आवश्यकता के बिना ट्यूमर के विकास की ट्रैकिंग की सुविधा और एक सीधे आगे FACS द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं को अलग तरीका प्रदान करता है, यह संभव है ट्यूमर विशिष्ट निर्माताओं के लिए एंटीबॉडी के साथ ट्यूमर कोशिकाओं लेबल उनकी शुद्धि की सुविधा , हालांकि zebrafish में एंटीबॉडी धुंधला अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
अंत में, एक बार ट्यूमर कोशिकाओं प्रचार की घटनाओं दिए गए ट्यूमर के प्रकार के लिए निर्धारित किया गया है, यह संभव है इन assays का उपयोग करने के लिए तंत्र है कि अपने सेल आवृत्ति सरकार की पहचान है. उदाहरण के लिए, प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से पहले कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण, या प्रतिरोपित मछली खुद को दवाओं के साथ dosed किया जा सकता है सीमित मार्ग विशिष्ट inhibitors के साथ इलाज किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, ब्याज की एक जीन के साथ एक मंच सेल मछली को इंजेक्शन लगाने के द्वारा स्वयं ट्यूमर के आनुवंशिकी चालाकी से किया जा सकता है, ताकि परिणामस्वरूप प्राथमिक ट्यूमर जीन अधिक व्यक्त करेंगे. इन प्रयोगों में, स्वयं renewing सेल आवृत्ति पर कोई प्रभाव सीमित कमजोर पड़ने assays में मनाया जाएगा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुदान NIH 5T32CA09216 26 अनुदान (JSB के लिए), और K01 AR055619-01A1 और 3 K01 AR055619 03S1 (DML के लिए), के रूप में अच्छी तरह के रूप में एलेक्स नींबू पानी खड़े रहो फाउंडेशन द्वारा, हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट और अमेरिकन कैंसर द्वारा प्रदान की गई है सोसायटी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
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