جبل كله<em> في الموقع</em> التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5
Summary
هذا كله جبل<em> في الموقع</em> بروتوكول التهجين يناقش الخطوات الحاسمة التي تضمن نتائج ذات جودة عالية للتكرار للدراسات التعبير الجيني في الأجنة اليوم E8.5-E11.5 الماوس القديمة.
Abstract
جبل بأكمله في الموقع التهجين هو نهج مفيدة للغاية لتحديد أنماط التعبير الجيني في الأجنة. والإجراءات في الموقع التهجين هي طويلة وتطالب تقنيا مع خطوات هامة المتعددة التي تسهم مجتمعة في نوعية النتيجة النهائية. يصف هذا البروتوكول في العديد من التفاصيل الخطوات الرئيسية لتحسين مراقبة الجودة ووضع العلامات التحقيق الأداء. عموما، لدينا بروتوكول يقدم وصفا مفصلا من الخطوات الحاسمة اللازمة للحصول على نتائج عالية الجودة بتكاثر. أولا، نحن تصف جيل من (DIG) تحقيقات digoxygenin RNA صفت في النسخ عن طريق المختبر من القوالب التي تم إنشاؤها بواسطة الحمض النووي PCR. نحن وصف ثلاثة فحوصات مراقبة الجودة الحرجة لتحديد مقدار والنزاهة والنشاط المحدد للتحقيقات DIG-المسمى. هذه الخطوات مهمة لتوليد تحقيقا للحساسية كافية لكشف mRNAs والمحلية في جنين فأر كله.وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طرق لتثبيت وتخزين الأجنة اليوم E8.5-E11.5 الماوس القديمة في الموقع التهجين. ثم، نحن تصف طرق مفصلة لعملية الهضم محدودة K بروتين من الأجنة ميهت تليها تفاصيل عن ظروف التهجين، يغسل بعد التهجين والعلاج لإزالة ريبونوكلياز غير محددة التهجين التحقيق. يتم استخدام الأجسام المضادة AP-مترافق لتصور المسمى التحقيق والكشف عن نمط التعبير من نص الذاتية. وتظهر نتائج ممثلة من التجارب الناجحة والتجارب دون المستوى الأمثل نموذجية.
Protocol
Discussion
وقد تم تكييف الأساليب المبينة في هذا البروتوكول من عدد من المصادر المختلفة والأمثل لجبل كله E8.5-E11.5 الأجنة اليوم الماوس القديمة. طرق جبل بأكمله في الموقع التهجين الأجنة الفقارية وأول ما ظهرت في 1990s في وقت مبكر 2،5-12. وقد تم تكييف هذا البروتوكول أساسا من الطرق ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R21MH082360 (BGC) وR01HD056315 (إدارة الموارد الطبيعية)، وكذلك في جامعة جورجيا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
- Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
- Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
- Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
- Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
- Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
- Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
- Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
- Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).
