Summary
여기, 우리는 효율 높은 처리량을 설명
Abstract
낮은 urogenital 트랙트 (LUT)의 개발은 복잡한 프로세스입니다. 이 복잡 androgenic 신호와 상피 - mesenchymal 상호 작용의 1,2에 의존 태아 남성 요도에서 전립선 형성하는 동안 입증합니다. 전립선 개발을 담당하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 부적절 같은 양성 전립선 증식과 전립선 암 등 전립선 질환을 야기할 나중에 삶에 reawakened 아르 성장 메커니즘을 보여줄 수 있습니다.
개발 LUT는 해부학적인 몸의 구조도 복잡합니다. 신진 시간 전립선은 16.5 일 게시 개념 (DPC)에 시작하여 많은 세포 유형이 존재한다. Vasculature, 신경 및 평활근은 mesenchymal 기질 내에 3. 이 기질은 multilayered 상피와 주변 androgen 수용체 의존 paracrine 신호 4 태아 전립선에 상승을 제공합니다. stromal androgen의의 신분 수용체 - 응답 전립선 개발 및 이들 유전자에 대한 응답으로 전립선의 상피 ductal 형태가 완전히 이해되지하는 메커니즘에 필요한 유전자. 정확하게 세포 유형을 식별하고 그들 내의 특정 요소의 표현을 집중하는 능력은 더욱 전립선 개발을 이해하는 필수적입니다. 원위치 하이브리드화 년 (이쉬) 조직 내에서 mRNAs의 국산화에 대한 수 있습니다. 따라서이 방법은이를 통해 잠재적인 전립선 개발 규제를 elucidating, 패턴 및 신호 분자와 그 수용체의 표현의 타이밍을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 진동 마이크로톰 - 컷 섹션을 사용하여 태아 마우스 LUT의 mRNA 발현 패턴을 식별하는 높은 처리량 이쉬 기술을 설명합니다. 이 방법은 다른 이쉬 프로토콜을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. 슬라이드을 준수 얇은 섹션에 이쉬 수행하는 것이 기술적으로 어렵습니다, 모두 cryosections 및 파라핀 섹션은 종종 약한 신호 해상도로 결과를하면서 cryosections 자주 가난한 구조 품질을 가지고 있습니다. 전체 마운트 조직에 이쉬 수행하면 프로브 트래핑이 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 높은 처리량 기술은 세부 조직 아키텍처를 공개 두꺼운 상처 부분을 활용합니다. 수정 microfuge 튜브는 이쉬 절차를 수행하는 동안 부분을 쉽게 처리하실 수 있습니다. 4 mRNA의 성적의 최대함으로써 비용과 효율성 극대화를 줄이고, 최대 단일 실행에서 검색된 24 mRNA의 성적을 가진 단일 17.5dpc LUT에서 심사하실 수 있습니다. 이 방법은 여러 치료 그룹 따라서 해석 데이터에 대한 모든 편견을 제거, 동일하고 하나의 단위로 처리할 수 있습니다. 대부분의 pertinently 전립선 연구원이 방법은 전립선 ductal 네트워크에 상승을 제공 태아 쥐 요도의 낮은 높은 어번던스 mRNA의 성적의 공간과 시간적 위치를 제공합니다.
Protocol
1. PCR 생성 템플릿에서 Digoxigenin - 11 - UTP - 라벨 Riboprobe의 합성
- 유전자 특정 riboprobe을 합성하기 위해 유전자 cDNA 참조 시퀀스 (RefSeq)을 구하는 Entrez 진 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)를 사용합니다. cDNA 시퀀스의 3' - 지역에 대한 유전자 특정 PCR의 primers를 디자인하는 Primer3 프로그램 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5를 사용합니다. PCR 프라이머 선택에 대한 권장 매개 변수는 (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html) 다른 곳으로 설명되어 있습니다.
- 선택한 DNA 순서의 특이성을 평가하기 MegaBLAST 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6를 사용합니다. 0.01의 기대 임계값을 사용하는 경우, DNA 시퀀스는 특정 간주됩니다, 그것은 RefSeq 데이터베이스에있는 다른 시퀀스와 일치하지 않습니다.
- PCR은 riboprobe 템플릿을 증폭. PCR 반응 구성 요소 및 thermocycling 조건은 각 프라이머 세트에 최적화된해야합니다. 전형적인 50 μl 반응이 포함되어 있습니다 1X 버퍼, 2mM MgCl 2, 0.2mM dNTPs, 1X Q 솔루션 1μg cDNA, 2.5U DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소, 0.25μm primers, 그리고 nuclease없는 H 2 O.을 전형적인 thermocycling 프로토콜 94에서 초기 변성 ° 30sec에 대한 94 ° C의 40주기에 의해 다음 2min에 대한 C, 57 ° 30sec에 대한 C, 72 ° 1min 및 10 분 72 ° C에서 최종 확장에 대한 C를 포함합니다. PCR 반응에 사용되는 cDNA는 마우스 urogenital mRNA에서 합성됩니다.
- 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 분리, 젤 추출 키트를 사용하여 정화하고, 분광 광도법에 의한 정화 제품을 계량. 예상 수확량은 1.2입니다 - 3.6μg.
- 표시 riboprobe에 PCR 제품을 고쳐 쓰다. 전사 반응 (40 μl)이 포함되어 있습니다 : 400ng 정화 PCR 제품, digoxigenin 11 - UTP, 1X 전송 버퍼, 5U RNase 억제제 80U T7 RNA 효소와 nuclease없는 H 2 O.을 포함 1X 염기 라벨 믹스 37 품어 3 - 4hr ° C와 선동 샘플마다 30 분.
- 온 칼럼 DNase의 소화와 RNA의 정리에 대한 지침에 따라 riboprobes 정화 Qiagen RNEASY 미니 키트를 사용하십시오. 분광 광도법에 의해 riboprobes을 Quantitate. 예상 수확량은 40-20 μg이다. 1.5 %가 아닌 denaturing 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 나누어지는를 분리하여 프로브의 품질을 평가합니다. 고품질의 프로브는 최소한의 번짐과 별개의 밴드로 마이 그 레이션.
- riboprobe 구체적으로 목표를 인식하기 위해, 첫 번째 이쉬 실험에 대한 긍정적인 제어 조직을 포함합니다. riboprobe의 대상 mRNA 패턴이 긍정적인 통제 조직의 알려진해야합니다.
2. 진동 마이크로톰 블레이드의 준비 (앞에서 설명한 프로토콜을 기반으로) 7
- 인산염의 4퍼센트 낮은 용해 아가로 오스 솔루션을 준비 호수 (PBS)가 버퍼. 아가로 오스를 해산하고 62에서 솔루션을 유지하기 위해 마이크로 웨이브 솔루션 ° C.
- 12mm 직경 Millicell 문화 접시에서 잘 삽입하고 아가로 오스의 몰드로 사용할 폴리스티렌 반지를 유지 멤브레인를 제거하여 폴리스티렌 링 금형을 준비합니다. 각 사용하기 전에 RNase 억제제 솔루션에서 하룻밤 반지를 적시게.
- 부드러운 절삭의 표면을 보장하기 위해 100 % 농도에서 다음과 같은 용매로 rinsing하여 윌킨슨 블레이드의 표면에서 녹 억제제 및 기타 첨가제를 제거 : 석유 에테르, 크실렌, 클로로포름, 메탄올 및 MilliQ 물을. 2 개의 싱글 블레이드로 길이 이중 칼날을 분리합니다.
- Loctite 접착제와 마이크로톰 블레이드 윌킨슨 블레이드를 준수합니다. 마이크로톰 블레이드는 절단에 사용하지 않습니다, 그것은 윌킨슨 블레이드 강성을 추가합니다. 윌킨슨 블레이드의 최첨단에서 4mm - 마이크로톰 블레이드는 금속 가위와 한번 준수를 사용하여 윌킨슨 블레이드의 길이로 절단해야 3 상쇄해야합니다.
3. Sectioning에 대한 Urogenital 조직의 절개, 저장 및 준비
- PBSTw 솔루션을 준비 (PBS는 0.1 %를 포함 트윈 ™ 20 0.22μm Stericup를 통해 필터링 0.2mM 나트륨 azide, ® 필터 단위). 솔루션은 사전에 준비하고 25 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 4 밤새 갓 해부 마우스 LUT (방광, 요도 골반, 및 관련 Wolffian 및 Mϋllerian 덕트 - 파생 구조) · PBS에서 C는 4 % paraformaldehyde의 정착액을 포함 품어.
- 25 10 분에 대한 세척 ° C를 등급 메탄올 / PBSTw (1시 3분, 1시 1분, 3시 1분 V / V) 솔루션을 일련의에 의해 조직을 탈수. 하루 적어도 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 보관 샘플. 보관된 조직은 최소한 2yr 보관 수 있습니다.
- 보관된 조직을 rehydrating하여 sectioning 위해 조직을 준비합니다. 25 ° 등급 메탄올 / PBSTw 일련의 C (3시 1분, 1시 1분, 1시 3분 V / V) 솔루션에서 10 분 대한 씻으십시오.
- 절개하다와 요도에 연결된 trigone 지역의 대부분을 떠나, 방광의 약 3 분의 2를 버리고.
- 25 ° C 일반 유리 현미경 슬라이드에 아래 폴리스티렌 링 금형, 평평한를 놓습니다.
- 62 ° C 아가로 오스 솔루션과 2min 약 시원한와 함께 반지의 금형을 입력합니다.
- PBSTw에서 LUT 조직을 제거하고 닦아 흡수에 건조 얼룩.
- 아가로 오스 솔루션으로 조직을 전송합니다.
- 오리엔트가 아가로 오스는 경화되었습니다 ° C까지 링 몰드의 상단과 하단 사이의 중간 정지와 4에서 조직을 품어되도록 아가로 오스의 LUT 조직 집게를 사용하십시오.
- 조직은 아가로 오스의 응고의 과정을 완전히 싱크면, 그것은 아가로 오스 다시 임베디드에서 excised 수 있습니다. 로 다시 삽입 과정에서 필요한 아가로 오스의 냉각 시간을 조정합니다.
5. 진동 마이크로톰 (앞에서 설명한 프로토콜을 기반으로) 7 Urogenital 조직을 Sectioning
- 진동 마이크로톰의 강화 윌킨슨 블레이드를 탑재하고 35 °로 블레이드 각도를 설정합니다. 표본 욕조 주변 PBS 및 서부 유럽 표준시 팩 얼음 표본 고급 욕조를 채우십시오.
- 반지의 금형에서 확정 아가로 오스 플러그를 제거하고 닦아 흡수와 하단의 표면을 얼룩. 조직이 제대로 방향되었는지 확인합니다. 조직 방향은 베벨 아가로 오스 플러그의 평면 가장자리를 면도날을 사용하여 조정할 수 있습니다.
- 로 그림과 같이 Loctite 접착제와 디스크를 장착 진동 마이크로톰 표본에 아가로 오스 플러그를 준수합니다. 1A.
- vibratome에 표본 설치 디스크를 넣습니다.
- 4 50μm, 2 속도, 그리고 블레이드 진폭에 마이크로톰 섹션의 두께를 조정하고 조직 섹션을 절단 시작합니다.
- 얼음처럼 차가운 0.5mL PBSTw를 포함 잘 24 잘 문화 플레이트 각 조직 섹션 (그림의 1B)를 전송하는 날이 집게를 사용하십시오.
- 원위치 하이브리드화, 소비세의 각 조직과 (나머지 아가로 오스는 이쉬 절차를 수행하는 동안 용융됩니다) 주변의 아가로 오스의 대부분을 샘플을 준비하고 관련된 모든 파편을 제거하려면 다음과 같이하십시오. 4 48hr 저장할 섹션 최대 ° PBSTw에서 C.
6. 원위치 하이브리드화에 대한 예제 바구니 준비
- 100μL 마르크에서 microcentrifuge 관의 바닥을 잘라.
- 플라스틱이 부드럽게 될 때까지 불꽃에 튜브의 절단 가장자리를 열, 다음 단단히 0.5in 폴리 에스테르 메쉬 광장의 중심에 microcentrifuge 관을 누르십시오.
- 초과 메쉬를 트림 및 바구니 준비 (그림 1C)를 완료하기 위해 각각의 관 뚜껑에 피어스 구멍에 가열 18 게이지 바늘을 사용합니다.
- 24 잘 접시의 뚜껑을 제거하고 각 넘는 중심 12mm 구멍을 드릴. 이쉬 프로토콜의 세척 (그림의 1D) 사이 샘플 바구니를 전송하기 위해 뚜껑을 사용합니다.
7. 원위치 하이브리드화에서에 대한 배아 분말 준비 (앞에서 설명한 프로토콜을 기반으로) 8
- 같은 평가되는 조직 섹션으로 무대와 -80에서 저장 ° C. 아르 마우스에서 마우스 배아 조직을 수집 액체 질소의 세라믹 박격포, 잠수함 조직에 냉동 조직을 장소, 훌륭한 분말로 조직을 분쇄하는 유봉을 사용합니다.
- 아세톤 4 권과 배아 분말을 결합하고 다운스 균 질기의 여러 스트로크와 균질.
- 나사 최고 유리병 15mL 유리 homogenate 전송과 4에서 하룻밤 추출 ° C.를
- 4 10 분 대한 5000rpm에서 원심 분리하여 펠렛의 배아 분말 ° C. 제거하고 지질 함유 뜨는을 삭제. 신선한 아세톤의 4vol에서 조직 펠렛을 Resuspend 4에서 2 시간에 대한 추출 ° C.
- 펠렛 4 10 분 대한 5000rpm에서 원심 분리하여 배아 분말 ° C. 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 항공은 # 2 왓먼 거름종이에 펠릿 건조. 4 단단히 밀봉 유리관에 좋은 분말 및 저장을 양보하는 펠렛을 호감 ° C.를 대략적인 수확량은 1g의 배아 서부 유럽 표준시 무게 50 MG 가루입니다.
8. 원위치 하이브리드화의 날 1
- 60.5에 앞서 열을 가하다의 prehybridization 솔루션 (50 % 포름 아미드, 배 SSC, 1 % 차단 시약, 10μg/mL 효모 tRNA, -20에서 10μg/mL 헤파린 저장 ° C)가 ° C. 이 솔루션은 사전에 준비하고 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 수돗물의 약 0.5와 작은 플라스틱 스토리지 컨테이너를 작성하여 humidified 하이브리드화 챔버를 준비합니다. 60.5 ° C.에 컨테이너와 앞서 열을 가하다 커버
- 24 잘 문화 판의 우물에 2mL PBSTw를 추가합니다. 바구니 (바구니 당 최대 10 섹션 사용되었습니다)로 24 잘 플레이트 덮개 및 전송 조직 섹션의 구멍에 넣어 샘플 바구니.
- 25 30 분에 대한 조직 섹션을 품어 ° C 6% H 2 O 2인치 달리 지시하지 않는 한 이것은 모든 후속 incubations은 궤도 쉐이크에 부드러운 교반과 함께 진행되어야합니다. 모든 incubationsD의 세척 24 - 잘 접시에 실시 2mL/well의 토탈 솔루션 볼륨을 사용합니다.
- 25 ° PBSTw에 C에서 조직 섹션에게 4 X 5 분 씻으십시오.
- 25 12min위한 조직 섹션을 품어 ° PBSTw에 C가 5μg/mL proteinase K.를 포함하는
- 25 ° PBSTw에 C에서 조직 섹션 1 X 5 분 씻으십시오.
- 25 20 분에 대한 포스트 수정 조직 섹션 ° PBS에서 C는 4 % paraformaldehyde와 0.2 % 글루 타 알데히드를 포함하는.
- 조직 섹션 25 2 X 5 분 ° PBSTw에서 C를 씻으십시오.
- prewarmed prehybridization 버퍼의 2mL/well를 추가하고 60.5 적어도 1 시간에 대한 humidified 하이브 리다이 제이션 챔버 ° C. 내부 조직 섹션을 품어
- 60.5에서 humidified 하이브 리다이 제이션 챔버에서 하룻밤 각 잘하고 품어 조직 섹션에서 prehybridization 버퍼에 0.65μg 레이블 riboprobe 추가 ° C.
9. 원위치 하이브리드화의 날 2
- 솔루션 1 (50 % 포름 아미드, 배 SSC, 1 % SDS) 솔루션 2 (10mM 트리스 - HCL 산도 7.5, 0.5M NaCl, 0.1 % 트윈 ™ 20, 0.2mM 나트륨 azide : 사후 하이브 리다이 제이션 세척 단계는 다음과 같은 솔루션을 준비 ) 필터링 0.22μm, 및 솔루션 3 (2X SSC, 50 % 포름 아미드). 이러한 솔루션은 사전에 준비하실 수 있습니다. 솔루션 1, 3이 -20 ° C 및 솔루션 2 저장되어있는 것은 25 저장됩니다 ° C. 솔루션의 저장 수명은 최소 3 개월입니다.
- 60.5에서 조직 섹션에게 3 X 30 분 씻으 ° C 미리 예열 솔루션 1. 세척하는 동안 humidified 챔버를 사용합니다.
- 60.5에서 조직 섹션 1 X 10 분 씻으 ° C 미리 예열 솔루션 1/Solution 2 (1:1 V / V) 솔루션. 세척하는 동안 humidified 챔버를 사용합니다.
- 솔루션 2 25 ° C에서 조직 섹션에게 4 X 10 분 씻으십시오.
- 37 15에 대한 조직의 섹션을 품어 ° 솔루션에 C 2 포함 0.25μg/mL RNase.
- 25 조직 섹션 1 X 10 분 씻으 ° 솔루션 2 C (RNase 제외).
- 25 조직 섹션 1 X 10 분 씻으 ° 2 X1hr 다음 솔루션 3 C는 솔루션 3 60.5 ° C에서 씻는다. 60.5 ° C의 세척 동안 humidified 챔버를 사용합니다.
- 발굴 - 라벨 riboprobes의 immunohistochemical 검출을위한 다음과 같은 솔루션을 준비 : 조직 차단 버퍼 (TB, 1X TBS 10 % 양 묘약, 1 % 차단 시약, 1 % BSA, 0.1 % 트윈 ™ 20, 0.22μm가 여과), 항체 희석은 버퍼 (AD, 1xTBS 5 % 양 묘약, 1 % 차단 시약, 1 % BSA, 0.1 % 트윈 ™ 20, 0.2mM 나트륨 azide, 0.22 ™ m는 필터링) 항체 흡수 버퍼 (AA, 1xTBS 5 % 양 묘약, 1 % 차단 시약, 1 % BSA, 6mg/mL 배아 분말) 및 TBSTw (1xTBS, 0.1 % 트윈 ™ 20, 0.2mM 나트륨 azide, 0.22μm는 필터링). 이러한 솔루션은 사전에 준비하실 수 있습니다. TBSTw 25 ° C에서 저장되는 다른 모든 솔루션은 -20 ° C.에 저장됩니다
- 25 3 X 10 분 ° TBSTw와 C를 씻으십시오.
- 25 적어도 2 시간 ° C TB 버퍼에있는 조직 섹션을 품어.
- 조직은 결핵 버퍼 잠복기 있지만, 각 잘 대해 200μL AA 버퍼 당 1.1μL 방지 발굴 항체를 추가합니다. 부화 AA 버퍼 + 항체 4 적어도 2 시간 ° C, 1min 다음 10,000 rpm으로 원심 분리기. AA 버퍼 뜨는을 제거하고 AD 버퍼의 2mL에 추가합니다.
- TB 버퍼에서 조직 섹션을 제거하고 4 humidified 챔버에서 그들이 밤새 품어 ° C 항체를 포함하는 AD 버퍼 인치
10. 원위치 하이브리드화 주 3
- 색상 개발 솔루션 NTMT을 (100mM 트리스 - HCL 산도 9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl 2, 0.2mM 나트륨 azide, 0.22μm 필터) 준비합니다. 이 솔루션은 사전에 준비하고 25 ° C.에 저장할 수 있습니다 바로 전에 사용 2mM의 levamisole을 추가하고 0.1 % 트윈 ™는 20.
- 4 우물 및 저장 솔루션 ° C.에서 항체 솔루션 (AD 버퍼 + 항체) 삭제 그것은 두 개의 추가 시간까지 활용할 수 있습니다.
- 25 조직 8 X 10 분 씻어 ° TBSTw와 C는 2mM의 levamisole을 포함.
- 조심스럽게 TBSTw을 포함하는 페트리 접시에 바구니에서 조직을 전송. 보이는 파편을 제거하는 집게를 사용하십시오. 깨끗한 microcentrifuge 튜브로 조직을 전송합니다.
- 조직 25 1 X 10 분 ° 1mL의 NTMT와 C를 씻으십시오.
- NTMT를 제거하고 25 가벼운 보호 상자 부화에 50 % NTMT (2mM의 levamisole를 포함)의 50 % BM 퍼플, 장소의 튜브를 포함하는 혼합물의 1mL/tube ° C.를 추가 색상 개발 시간은 몇 시간에서 며칠 범위. 색상 개발 속도가 느린 경우, 100 % BM 퍼플 사용할 수 있습니다.
- 모니터 색상 개발과 변화 NTMT / BM 퍼플 솔루션은 시켰던 결정 누적 경우 또는 보라색에 노란색에서 색상의 변화를 겪습 경우. 전체 컬러 개발 후 (4~250시간), 씻어 조직 25 2 X 5 분 ° 2mM의 levamisole을 포함 NTMT의 1mL/tube와 C.
- 4 박 조직을 품어 ° PBS의 1mL/tube에서 C는 4 % paraformaldehyde 후 정착액을 포함.
- 표백하려면 조직, 25 30 분 대한 품어 조직 ㆍ PBSTw의 1mL/tube에서 C 3 % H 2 O 2를 포함하는
- 조직 섹션은 유리 슬라이드에 장착된 coverslipped 및 복합 현미경으로 몇 군데 있습니다.
11. 대표 결과 :
아가로 오스의 LUT 조직의 공간적 방향 조직 섹션의 비행기를 결정합니다. 화살 섹션 들어, 방광의 최소 3 분의 2가 excised되고 나머지 LUT 조직은 요도 정중선은 아가로 오스 플러그 (그림 1A)의 평면에 평행는 그러한 한천에 모두 담겨있다. 조직 비행기에 대한 사소한 조정은 아가로 오스 플러그의 평면 가장자리를 beveling하여 만들 수 있습니다. 이 비행기에서 지향하는 17.5dpc 남성 LUT 조직의 대표 화살 섹션 그림 1B에 표시됩니다.
샘플 바구니 손실 및 멀티 일 이쉬 절차를 수행하는 동안 먼지와 미립자 물질을 축적에서 섬세한 조직 섹션을 보호합니다. 샘플 바구니는 1.5mL microfuge 튜브 (그림 1C)의 컷 끝까지 폴리에스터 메쉬를 용융하여 준비가되어 있습니다. 작은 구멍으로 밖 바구니의 솔루션 흐름을 촉진하기 위해 각 샘플 바구니의 뚜껑에 피어싱입니다. 샘플 바구니 24 - 잘 접시 뚜껑 (그림 1D)로 몰락 12mm 구멍에서 그들을 배치하여 이쉬 솔루션에 일시 중지됩니다. 수정된 플레이트 뚜껑들은 솔루션을 변경하는 동안 24 잘 플레이트 사이에 전송됩니다 바구니를 지원합니다.
그것은 낮은 어번던스 mRNAs의 검출에 필요한 긴 배양 기간 동안 불특정 배경 얼룩을 제한하는 도전이다. 0.22μm 필터를 통해 샘플 버퍼에 0.2mM 나트륨 azide와 그 이후의 여과의 추가 배경 얼룩 (그림 2)를 제한하는 것처럼 보였다. 여기에서 설명한 방법을 사용하여 샘플을 연장 기간 (그림 3) 색상의 개발 솔루션에 incubated 때 배경 얼룩에 표시 차이가있을 나타나지 않습니다.
그림 1. 마우스 낮은 urogenital (LUT) 트랙트 조직 섹션 및 microcentrifuge 관 이쉬 위해 바구니의 작성. 방광, 요도 골반과 관련 Wolffian 및 Mϋllerian 덕트 - 파생 구조)의 일부를 포함하는 LUT는 4% 낮은 용융 아가로 오스의 원통형 플러그에 모두 담겨있다. (A) 플러그는 표본 설치 디스크로 붙어 있으며, (B) 진동 마이크로톰와 50μm 섹션으로 했네요. (C) LUT 섹션은 튜브의 절단 바닥 끝에 관 뚜껑과 융합 폴리에스터 메쉬에 구멍을 천공하여 준비 microcentrifuge 튜브 바구니로 전송됩니다. (D) microcentrifuge 관은 조직 섹션이 이쉬 프로토콜 중 버퍼 용액에 정지되도록 24 웰 플레이트 뚜껑에 구멍을 뚫고 12mm에 삽입됩니다. 화살촉은 아가로 오스 플러그의 LUT 조직을 나타냅니다.
그림 2. 0.22μm 필터링 솔루션에 0.2mM 나트륨 azide의 설립은 조직의 품질을 향상시키고 배경 얼룩을 줄일 수 있습니다. 17.5dpc 남성 마우스 낮은 urogenital 책자 (LUTs)는 50μm의 두께로 화살 비행기에서 sectioned되었습니다. 조직 섹션은 트위스트 상동체 일에 대한 감독 프로브를 사용 이쉬 물들어 있었다. 이쉬에 사용되는 버퍼는 중했다 (A) 0.22μm는 필터링 및 0.2mM 나트륨 azide (NaAz)로 보충 또는 (B) 필터없는 아닌 NaAz과 보완. 화살촉 배경 얼룩을 나타냅니다. 이미지는 동일한 배율로 점령했다. 결과는 N = 3 쓰레기 독립적인 생쥐에 대한 대표적인 얼룩 패턴입니다.
그림 3. 배경 얼룩 강도는 오랫동안 색상 개발과 증가가 나타나지 않습니다. 17.5dpc 남성 마우스 낮은 urogenital 책자 (LUTs)는 50μm의 두께로 화살 비행기에서 sectioned되었습니다. 제는 (A) 9.5h는 (B) 43.5h에 대한 매체 풍요를 인식 프로브를 사용하여 높은 어번던스 성적표 에스 트로겐과 관련된 수용체 감마 (Esrrg)를 인식 프로브를 사용 chromagen의 얼룩 솔루션에서 그들을 잠복기로 이쉬 물들어 있었다 아연 손가락 도메인에 인접한 대본 bromodomain, 2A (Baz2a) 또는 (C) 낮은 어번던스 성적표 천사 타입 MMTV 통합 사이트 가족 구성원 10A (Wnt10a)를 인식 프로브를 사용하여 236h하십시오. 이미지는 동일한 배율로 점령했다. 결과는 N = 3 쓰레기 독립적인 생쥐에 대한 대표적인 얼룩 패턴입니다.
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Discussion
방법을 사용하면 여기에 설명된, 그것은 주요 세포 유형 및 mesenchymal 패드, urothelium, 부드러운 근육, 전립선 꽃봉오리, ejaculatory 덕트 및 질을 포함하여 태아 남성과 여성의 마우스 LUTs의 조직 구획의 모든 mRNAs를 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 50μm 섹션은 조직 구조 (예 : 혈관 등) 해결하기 위해 충분한 두께가되는 장점을 가지고 있지만 일반적으로 전체 마운트 이쉬 동안 발생한 방법론 문제 프로브 트래핑을 피할 정도로 얇은 있습니다. 얼룩이 이전의 출판 연구 평가되어 어디에 모든 새로운 riboprobe은 긍정적인 제어 조직에 부과됩니다. 우리는 얼룩 패턴이 조직에있는 특정 있는지 확인합니다. 우리의 방법의 또 다른 장점은 여러 mRNAs의 패턴이 동일한 LUT 조직에서 인접 조직 섹션에 평가 될 수있다는 것이다. 또한,이 방법은 세포 특정 단백질 마커를 시각화하고 이쉬 프로토콜 스테인드 셀 형식을 식별하는 immunohistochemical 기법 결합 수 있습니다. 이 방법은 빠른 레드 hematoxylin과 핵 counterstaining와 같은 전통 counterstaining 방식과 호환되지 않습니다. 그러나, 우리는 4를 포함하여 형광 핵 얼룩 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)와 propidium 요오드화물의 성공적으로 counterstained 샘플을했습니다.
방법은 여기에서 설명한 이전 7 설명한 개 이상의 몇 가지 향상이 포함되어 있습니다. 거의 모든 현재 원고의 버퍼와 시약 주식 솔루션은 사전에 준비하고 효율성을 증가 오랜 기간에 대한 저장할 수 있습니다. 0.22μm 점막을 통해 대부분의 시약과 여과에 0.2mM 나트륨 azide의 추가는 크게 아닌 특정 배경 얼룩을 감소 이쉬 절차를 수행하는 동안 조직 섹션에 미립자 물질의 시약 선반 수명, 그리고 최소화 축적을 증가시킵니다. 이 원고는 이쉬와 버퍼를 변경하는 동안 바구니를 가지고 수정 다중 잘 문화 플레이트 뚜껑 동안 조직 섹션을 포함 투과 microcentrifuge 튜브 바구니의 제조에 대해 설명합니다. 우리는 쉽게 실험실에서 제조하는 것으로서 이러한 장치는,,, 샘플 손실을 줄일 수 처리하는 동안 조직 섹션 피해를 최소화하고, 효율성을 향상 것으로 나타났습니다. 또한, 습도 챔버로 sealable 플라스틱 용기의 사용은 증발을 방지하는 데 도움이됩니다. 이것은 소위 '에지 효과'실험 변수를 도입할 수 말초 샘플 우물에서 조직 섹션에 특히 중요합니다. 습도 챔버를 사용하는 동안, 우리는 주변 비해 내부 샘플 우물에서 감지할 수있을 정도의 얼룩 품질 차이를 관찰하지 않았습니다.
이 프로토콜은 마우스 LUT 조직에서 mRNA 발현 패턴을 연구하기위한 효율적인 메커니즘이지만,이 방법으로 몇 가지 제한이있다. mRNA 검출의 효율 riboprobes과 mRNAs 절대 풍부한 간의 차이는 결정 수 없습니다. 또 다른 한계는 얼룩 패턴의 시작 부분 평면에 따라 달라질 수있다는 것입니다. 이러한 한계를 최소화하기 위해, 우리는 여러 쓰레기 독립 fetuses에서 여러 섹션에서 각 mRNA 패턴을 평가합니다.
이 방법은 다른 마우스 조직 유형 또는 다른 수종의 mRNA 발현 패턴을 시각화에 대해 최적화할 수 있습니다. 이러한 수정은 마이크로톰 블레이드 진폭과 속도가 조직 sectioning 동안 최적화하고 proteinase K 농도가 이쉬 절차를 수행하는 동안 최적화해야합니다. 또한, 그것은 이쉬에 의해 평가되고 조직의 동일한 종류의 배아 분말과 안티 digoxigenin 항체를 미리 흡수하는 것이 필요합니다. 섹션 이쉬 얼룩 동안 분해하기 때문에이 방법은 40 미크론보다 얇은 조직 섹션에 대한 유용하지 않지만, 그것은 높은 처리량 전체 마운트 이쉬의 얼룩에 사용하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리는 태아와 신생아 마우스 전립선에뿐만 아니라 태아의 생식선과 신장 등 전체 마운트 이쉬를 수행하기 위해 성공적으로이 방법을 사용했습니다. 전체 마운트 이쉬의 얼룩 들어, proteinase K 조직 소화뿐만 아니라 프로브 트래핑에 의한 배경 얼룩을 줄이기 위해 야간 항체 보육에 따라 세척의 수량과 기간을 최적화하는 것이 필요합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 조직 바구니 준비에 기술 지원을위한 닥터 란 이순신, 뉴저지의 암 연구소, 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 DK083425 및 DK070219 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
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- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
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