Summary
We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren van
Abstract
Achterste ledematen spieren van knaagdieren, zoals de gastrocnemius en de m. tibialis anterior, worden vaak gebruikt voor in vivo farmacologische studies van de signalen essentieel voor de vorming en instandhouding van zoogdieren NMJs. Echter, drugs penetratie in deze spieren na subcutane of intramusculaire toediening is vaak onvolledig of oneffen en vele NMJs kunnen blijven onaangetast. Hoewel de systemische toediening met apparaten zoals mini-pompen kunnen het verbeteren van de spatiotemporele effecten, kan het invasieve karakter van deze aanpak leiden tot verwarrende ontstekingsreacties en / of directe spierschade. Bovendien is het volledige analyse van de NMJs in een achterste ledematen spier een uitdaging, want het vereist tijdrovende serie snijden en uitgebreide immunokleuring.
De muis LAL is een dunne, vlakke plaat van de spieren oppervlakkig gelegen op het dorsale gedeelte van de nek. Het is een fast-twitch spier die functies te bewegen de oorschelp. Het bevat rostrale en caudale delen die afkomstig zijn van de middellijn van de schedel en uit te breiden zijdelings aan de kraakbenige gedeelte van elk oorschelp. De spier wordt geleverd door een tak van de nervus facialis die caudaal projecten dat uit de stylomastoid foramen. Wij en anderen hebben gevonden LAL naar een geschikte preparaat dat voordelen voor het onderzoek van zowel korte als lange termijn in vivo effecten van drugs op NMJs en spieren aanbiedingen zijn. De eerste, de oppervlakkige ligging maakt meerdere lokale toepassingen van drugs onder lichte narcose. Ten tweede, de dunheid (2-3 lagen van spiervezels) staat visualisatie en analyse van bijna alle NMJs binnen de spier. Ten derde, het gemak van ontleden met zijn zenuw intact, samen met het patroon van de innervatie vergunningen aanvullende elektrofysiologische analyse in vitro 9,5. Laatste, en misschien wel het allerbelangrijkste, een klein toegepaste volume (~ 50μl) dekt met gemak de hele spier oppervlak, zorgt voor een uniforme en langdurige blootstelling van al haar NMJs om het geneesmiddel en elimineert de noodzaak voor een systemische benadering 1,8.
Protocol
1. Subcutane toediening van muscarine acetylcholine receptor (mAChR) antagonisten
- Bereiden onder aseptische omstandigheden de juiste dosis van mAChR antagonist, (cf. tabel) door het oplossen van het geneesmiddel in steriele fysiologische zoutoplossing in 1,5 ml reactie buis. De volgende antagonisten werden gebruikt: atropine, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Teken 50μl van de oplossing in a1cc insulinespuit en gebruik een aparte spuit voor elke muis. Ook voorbereiden spuiten met fysiologisch zout alleen voor elke muis in de controle groep. Blijven spuiten op ijs pas klaar om te injecteren.
- Verdoven muizen met ketamine-xylazine cocktail (120 mg / kg ketamine, 8 mg / kg xylazine) Controleer voor de juiste verdoving diepte door het observeren van het gebrek aan reactie op knijpen teen.
- Na een goede sedatie, scheren haar met betrekking tot de rostrale regio van het hoofd naar de caudale regio van de nek, veeg de resterende haar weg met 70% ethanol.
- Plaats de muis onder stereomicroscoop, en steek de naald parallel aan LAL spieren tijdens het omhoog te trekken licht op de naald van de spuit (afb. 1A, B). Dit zorgt ervoor dat de naald wordt ingebracht in bovenliggende bindweefsel en niet direct schade aan de LAL spier zelf. Steek de naald, zodat het uiteinde dekt de caudale aspect van de LAL spier.
- Heel langzaam beginnen te oplossing te injecteren in de juiste LAL spier, terwijl intrekking van de spuit, de totale injectie tijd moet ongeveer 1 minuut. Als dit goed wordt geïnjecteerd, moet de oplossing vormen een 'koepel', dat is ongeveer 1 cm in diameter, in de bovenliggende huid die zal blijven gedurende ten minste een uur. Een uniform geïnjecteerde oplossing betrekking op de gehele rostrale en caudale regio van de juiste LAL spier.
- Herhaal de procedure om de 12 uur gedurende 1 tot 7 dagen. Voor andere studies1, gebruikten we hetzelfde protocol te injecteren groeifactoren elke 12 uur gedurende maximaal 21 dagen. Geen abnormale respons waargenomen van muizen toegediend met anesthesie 2x per dag gedurende maximaal 21 dagen.
2. Dissectie van LAL spieren
- Euthanaseren muizen met een overdosis natriumpentobarbital (390 mg / kg). De dood is verzekerd door beoordeling van het gebrek van de hartslag na een thoracotomie wordt uitgevoerd.
- Vastpinnen de muis in een dissectie schaal-, rug-kant naar boven met een pin in elke poot en een pin door de neus.
- Maak de eerste incisie door de huid alleen met behulp van kleine lente schaar te snijden langs de linkeroever LAL uit de regio net proximaal van het oor naar de regio rond de linker schouderblad.
- Verwijder voorzichtig de huid in deze regio, maar vermijd het snijden te dicht bij de rechter oor als deze is een van de bevestigingspunten voor de juiste LAL spier.
- Zoek de centraal geplaatste vetweefsel strook van lipide over de middellijn, op het oppervlakkige oppervlak van het hoofd, waar de rechter en linker LAL spieren te voldoen. Met behulp van kleine lente een schaar, knip 1 cm aan de rechterkant van het vetweefsel (in de richting van het linker oor) van de proximale rand van de linker LAL spier tot het bereiken van de schouder (Fig. 1C).
- Nadat de incisie wordt gemaakt, schil de rug van de juiste LAL spier met kleine tang aan de ventrale zijde van de spier bloot te leggen. Trim het bindweefsel en de fascia terwijl zorgvuldig omhoog te trekken aan de rechterkant LAL spier met een pincet (Fig. 1C).
- Snijd rond het caudale einde van de juiste LAL aan de basis van het oor. Blijven snijden, op weg naar de rostrale einde van het rechteroor, het bijhouden van de juiste LAL omgedraaid (afb. 1C).. Het is beter om meer weefsel ten deze stap is dan het risico beschadiging van de LAL zelf. Als de spier begint te drogen, pipet 1X PBS over de spier.
- Plaats ontleed recht LAL in 30mm cultuur Sylgard schotel met 1X PBS-, rug-kant naar boven. Vastpinnen vier de hoeken van de spier met kleine insect pinnen.
- Met kleine tang en de lente schaar, schone bindweefsel van de dorsale en ventrale oppervlak van de juiste LAL spier. Draai de spieren om en re-pin, om schoon te buikoppervlakte. 2-3 spieren kunnen worden geplaatst in dezelfde 30mm schotel.
3. Triple immunokleuring van LAL NMJs: Dag 1
- Voor het begin van immunokleuring, bereiden alle benodigde reagentia. 1X PBS, 2% boviene serumalbumine BSA) / PBS, 0,1 M glycine in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS, en 4% paraformaldehyde (PFA) in 1X PBS nodig zal zijn. Pre-cool methanol in -20 ° C vriezer.
- Laat LAL spieren gespeld in de schotel dorsale zijde tijdens dit proces. Gooi 1X PBS-oplossing en voeg genoeg 4% (PFA) om de spier te dekken. Plaats schaal op shaker ingesteld op snelheid 2 of 3 voor 20 minuten. Tenzij anders vermeld, dient de schotel worden geplaatst op een shaker voor de volgende stappen.
- Weggooien 4% PFA en was de spier met 1X PBS 3 keer, 10 'per stuk.
- Gooi laatste 1X PBS wassen en 0,1 M Glycine toe te voegen in 2% BSA / PBS-oplossing voor 30 '.
- Gooi 0,1 Glycine-oplossing eend toe te voegen 1X PBS met rhodamine geconjugeerde α-bungarotoxin bij een concentratie van 1:200 voor de 15 '.
- Gooi α-bungarotoxin oplossing weg en was spier in 1X PBS, 3 maal 10 'per stuk.
- Permeabilize weefsel door het toevoegen van pre-cooled methanol en plaats de schaal in de -20 ° C vriezer voor precies 5 minuten, geen schudden nodig.
- Verwijder de methanol en was drie keer 10 'elk met 1X PBS. Gooi laatste wassen en te blokkeren weefsel met 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS gedurende 1 uur. Het wassen en het blokkeren van stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- 'S nachts Incubeer de spieren, beven, bij 4 ° C in een cocktail van primaire antilichamen verdund in de blockingbuffer (cf. tabel).
4. Triple immunokleuring van LAL NMJs: Dag 2
- Was de spieren in 1X PBS 3 keer, 10 'elk op kamertemperatuur.
- Voeg cocktail van secundaire antilichamen in het blokkeren van oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (cf. tabel). De spieren moeten beschermd worden tegen het licht van deze stap verder naar foto-bleken van Alexa Fluor 647-fluorescentie te voorkomen.
- Was de spieren in 1X PBS 3 keer, 10 'per stuk.
- Veeg eventueel resterende bindweefsel in 1X PBS, snijd de laterale grenzen van de LAL spieren en monteren op dia's dorsale kant naar boven, met behulp van glazen cover-slips en montage media. Gebruik duidelijke nagellak te dekken slip in plaats veilig te stellen.
- Bescherm dia's van licht en bewaar bij -20 ° C tot aan analyse.
5. Confocale beeldvorming van LAL NMJs
- Hoge-resolutie confocale beelden worden verkregen met een Leica Apo Plan 63x olie doelstelling (1.4NA) op een Leica TCS 4D confocale microscoop.
- Fluoresceïne en Alexa 647 signalen werden tegelijkertijd gescand met een laser-lijnen 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) en 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectievelijk. Sequentieel, is Rhodamine signaal vervolgens gescand met de laserlijn 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Optische secties werden verzameld bij 0,3 micrometer intervallen en het aantal beelden in de z-plane varieerde 60 tot 80. De pinhole wordt aangepast aan een Airy (107,97 um). Het beeld formaat 1024 x 1024 (X, Y), met een zoom factor van 1, bij 400Hz snelheid resulteert in een beeldgrootte van 234.32 x 234.32 um um en de pixelgrootte van 229,05 nm x 229,05 nm.
- Leica TCS-NT acquisitie software wordt vervolgens gebruikt om z-serie beelden te reconstrueren tot maximale intensiteit projecties.
- Multipanel beelden worden aangepast voor de helderheid en het contrast met behulp van Adobe Photoshop.
- Voor een typische LAL spier, moet men in staat zijn om ongeveer 75 tot 100 en face NMJs te analyseren. Synaptische stabiliteit wordt bepaald door kenmerken zoals ruimtelijke afstemming van pre-, peri-en postsynaptische elementen (dat wil zeggen, zenuw-, Schwann-cellen en spieren), en metingen van synaptische gebied (dat wil zeggen, synaps grootte).
Representatieve resultaten:
Bij de volwassen zoogdieren NMJ, een enkele motor axon gaat in fijne takken die zeer gedifferentieerde cilinders van een zenuw klem (afb. 2, Green) vormen op een enkele spiervezel, juist apposed aan de postsynaptische clusters van nicotinezuur AChRs (Fig. 2; Rood) . Perisynaptically, terminal Schwann-cellen goed voor alle takken van presynaptische zenuwuiteinden (afb. 2, Blauw). De structurele en functionele integriteit van deze tripartiete organisatie wordt ernstig verstoord door de dagelijkse toepassing van de subtype-specifieke mAChR remmers. In het voorbeeld hier gepresenteerde (afb. 3), 4-DAMP, een mAChR antagonist met een hoge affiniteit voor M1, M3, M4 en M5 mAChR subtypes, roept selectieve eliminatie van zenuwuiteinden uit talrijke NMJs de hele spier oppervlak (Fig. 3B, C). Daarnaast terminal Schwann-cellen zijn abnormaal latente 8, zoals blijkt uit heldere S100 etikettering zonder proces extensie (Fig. 3B ", 3C"). Postsynaptically, spiervezels zijn normaal en er is geen verlies van nAChRs (Fig. 3B ", 3C ').
Figuur 1. Anatomische locatie en de organisatie van de LAL spier. Locatie van de rostrale (rLAL), caudaal (cLAL), en de LAL zenuw (LALn) en de bijbehorende eindplaat banden worden weergegeven (A, inzet). De locatie en oriëntatie van de naald ten opzichte van de LAL spier wordt getoond voor de injectie procedure (B). Incisie punten worden weergegeven voor de dissectie procedure (C).
Figuur 2. Tripartiete organisatie van de NMJ. High-vergroting confocale opvattingen van een muis NMJ. Een enkele axon gaat in fijne takken klem (A), stevig onder de terminal Schwann-cellen en hun processen (A ', sterretjes punt klem Schwann cellichamen). Postsynaptically in een spier vezel, is een cluster van nicotine AChRs precies apposed aan de takken van de zenuw termisignalen en terminal Schwann-cellen.
Figuur 3. LAL spieren die behandeld worden met 4-DAMP, een mAChR antagonist. Lage en hoge vergroting confocale opvattingen van LAL spieren die werden behandeld met het voertuig of 4-DAMP. In tegenstelling tot de auto-behandelde spier (A-A'''), talrijke NMJs in de 4-DAMP-behandelde spier gebrek zenuwuiteinden (B-B''', C-C'''). Een omkaderde gebied in Figuur 2B is ingezoomd figuur 2C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode maakt hier gepresenteerde onderzoek van niet eerder opgenomen rollen van subtype-specifieke mAChR signalering in de stabiliteit en het onderhoud van zoogdieren NMJs. Deze methode zal ook nuttig zijn om de effecten van neurotrofe factoren en farmacologische stoffen te testen. Bijvoorbeeld: ons laboratorium bleek dat ciliaire neurotrofe Factor (CNTF) veroorzaakte ontspruit uit bijna alle LAL zenuwuiteinden in volwassen muizen 1 . Dit resultaat in contrast met eerdere studies van CNTF behandelde achterste ledematen spieren, die meldde matig kiemen op ca.. 13-33% van de gluteus en bij 9% van de laterale gastrocnemius knooppunten 3. Wij geloven dat het verschil te wijten was aan meer uniforme en langdurige blootstelling van de zenuwuiteinden te CNTF in LAL dan in de achterste ledematen spieren. Inderdaad, wanneer we CNTF toegepast op de laterale gastrocnemius en de m. tibialis anterior spieren met hetzelfde protocol dat op grote schaal ontspruit uit bijna alle LAL NMJs uitgelokt, zagen we zwak ontspruit uit slechts een bescheiden aantal NMJs dat bij voorkeur lag in de buurt van de injectieplaats. Blijkbaar had de blootstelling van het achterbeen NMJs om CNTF is beperkt en ongelijkmatig, zoals ook vermeld in een eerdere studie 2 . Aan de andere kant, CNTF geïnjecteerd tussen de subdermale bindweefsel en de LAL fascia, maar niet CNTF subcutaan geïnjecteerd in achterste ledematen spieren, vormden een lokale zwelling subdermale dat voor ten minste een uur bleef voor de vasculaire reabsorptie. Het is ook opvallend dat, zelfs wanneer de injectie frequentie van CNFT of mAChR antagonisten werd verhoogd tot maximaal dagelijks tot vier keer, hebben we niet bijzonder additieve effecten van CNTF en mAChR antagonisten observeren. Bovendien, als de injectie procedure adequaat wordt uitgevoerd, is het onwaarschijnlijk dat een directe spier schade zou ontstaan. Echter, als een wel schade aan de spier tijdens de injectie procedure, axonale kiemen in het zenuwuiteinde of bij de knooppunten, en / of spiervezels degeneratie kan 1,8 worden waargenomen. Samengevat, LAL spieren zijn een uniek preparaat dat uniform, langdurige blootstelling van alle NMJs vergunningen binnen een spier met relatief eenvoudige en snelle procedures.
De smallere caudale deel van een LAL spier is dikker (3-5 spiervezels dik) dan de bredere rostrale gedeelte (2-3 spiervezels dik). Dienovereenkomstig worden NMJs geassocieerd met spiervezels diep gepositioneerd in caudale LAL vaak ofwel niet geëtiketteerd wholemount immunokleuring of geëtiketteerd alleen door α-bungarotoxin, die dieper doordringt dan antilichamen vanwege de kleinere afmetingen en een hoge affiniteit voor nAChRs. Deze NMJs kunnen verkeerd worden geïnterpreteerd als zijnde verloren zenuwuiteinden of Schwann-cellen als gevolg van specifieke effecten van de toegepaste geneesmiddelen. Het is daarom belangrijk om te weten of deze knooppunten alleen waargenomen in caudale LAL, en of de NMJs of spiervezels zijn oppervlakkig of diep geplaatst: oppervlakkig gelegen spiervezels worden meestal geassocieerd met een veel hogere achtergrond immunofluorescentie dan diep geplaatst vezels. Als alternatief kan men weglaten diep geplaatst NMJs in de caudale strook van de LAL van wholemount analyse.
Hoewel de volledige doorsnijding van de LAL zenuwen is relatief eenvoudig en ons toegestaan om de effecten van mAChR remming studie over gedenerveerde spieren, de grootte en de toegankelijkheid van de LAL zenuwen beperking van de soorten chirurgische benaderingen die kunnen worden onderzocht. Bijvoorbeeld, gedeeltelijk beschadigd LAL lef om gedeeltelijke denervatie van een LAL spier veroorzaken lijkt technisch zeer uitdagend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Vereniging voor Musculaire Dystrofie, NIH (NS062320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
