Summary
हम दोहराया muscarinic संकेतन के inhibitors के levator AURIS (लाल) longus युवा वयस्क चूहों की मांसपेशियों के लिए प्रशासन के लिए और अपने neuromuscular जंक्शनों के बाद wholemounts में (NMJs) immunostaining के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. लाल मांसपेशी खुलासा करने के लिए अद्वितीय फायदे हैं
Abstract
Gastrocnemius और tibialis पूर्वकाल जैसे कृन्तकों, हिंद अंग मांसपेशियों अक्सर स्तनधारी NMJs के गठन और रखरखाव के लिए आवश्यक संकेतों के vivo में औषधीय अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, इन मांसपेशियों में चमड़े के नीचे या इंट्रामस्क्युलर प्रशासन के बाद दवा पैठ अक्सर अधूरी है या असमान और कई NMJs अप्रभावित रह सकता है. हालांकि मिनी पंप के रूप में इस तरह के उपकरणों के साथ प्रणालीगत प्रशासन spatiotemporal प्रभाव में सुधार कर सकते हैं, इस दृष्टिकोण का आक्रामक स्वभाव confounding भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और / या प्रत्यक्ष मांसपेशियों की क्षति पैदा कर सकता है. इसके अलावा, पिछले अंग मांसपेशियों में NMJs का पूरा विश्लेषण चुनौती दे रहा है क्योंकि यह समय लेने वाली धारावाहिक सेक्शनिंग और व्यापक immunostaining की आवश्यकता है.
माउस लाल मांसपेशियों की एक पतली, फ्लैट शीट पर गर्दन के dorsum अल्पज्ञता स्थित है. यह एक तेजी से चिकोटी मांसपेशियों है कि कार्यों सुफ़ना स्थानांतरित करने के लिए. यह कि cranium के midline से उत्पन्न और प्रत्येक सुफ़ना की नरम हड्डी भाग के लिए laterally विस्तार व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम भाग होते हैं. मांसपेशियों चेहरे तंत्रिका कि यह stylomastoid रंध्र से बाहर निकालता है के रूप में caudally परियोजनाओं की एक शाखा के द्वारा आपूर्ति की है. हम और दूसरों के लिए एक सुविधाजनक तैयारी है कि NMJs और मांसपेशियों पर दवाओं के vivo प्रभाव में दोनों छोटी और लंबी अवधि की जांच के लिए लाभ प्रदान करता है लाल पाया है. सबसे पहले, अपने सतही स्थान प्रकाश संज्ञाहरण के तहत दवाओं के कई स्थानीय अनुप्रयोगों की सुविधा है. दूसरा, इसके thinness (मांसपेशी फाइबर के 2-3 परतों) और मांसपेशियों के भीतर लगभग सभी NMJs के दृश्य विश्लेषण परमिट. तीसरा, यह इसकी तंत्रिका बरकरार साथ अपने innervation के पैटर्न के साथ एक साथ विदारक आसानी 9,5 इन विट्रो में पूरक electrophysiological विश्लेषण परमिट . अंतिम है, और शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, एक छोटे से लागू मात्रा (~ 50μl) आसानी से पूरे मांसपेशियों की सतह को कवर, एक समान और लंबे समय तक अपने सभी NMJs की दवा के लिए जोखिम प्रदान करता है और एक प्रणालीगत 1,8 दृष्टिकोण के लिए की आवश्यकता eliminates.
Protocol
1. Muscarinic acetylcholine रिसेप्टर गरम (mAChR) के चमड़े के नीचे प्रशासन
- 1.5mL प्रतिक्रिया ट्यूब में बाँझ शारीरिक खारा में दवा भंग करके सड़न रोकनेवाला mAChR प्रतिपक्षी की उचित खुराक की स्थिति, (cf., टेबल) के तहत तैयार करें. पीछा कर रहे थे इस्तेमाल किया विरोधी: atropine, Methoctramine, 4-नम, AFDX - 116, AFDX 384, 7 मीट्रिक टन.
- A1cc इंसुलिन सिरिंज में समाधान का 50μl ड्रा और प्रत्येक माउस के लिए एक अलग सिरिंज का उपयोग करें. इसके अलावा, नियंत्रण समूह में प्रत्येक माउस के लिए केवल शारीरिक खारा युक्त सीरिंज तैयार करते हैं. बर्फ पर सीरिंज के लिए इंजेक्षन करने के लिए तैयार रखें जब तक.
- Ketamine xylazine कॉकटेल (120 ketamine मिलीग्राम / किग्रा, xylazine 8 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों को anesthetize प्रतिक्रिया की कमी देख चुटकी पैर की अंगुली के द्वारा उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई के लिए जाँच करें.
- उचित बेहोश करने की क्रिया के बाद, गर्दन की दुम क्षेत्र के लिए सिर के व्याख्यान चबूतरे वाला क्षेत्र को कवर बाल दाढ़ी, पोंछ बाल दूर 70% इथेनॉल के साथ शेष.
- Stereomicroscope के तहत रखें, माउस, और लाल मांसपेशियों सुई समानांतर सम्मिलित जबकि सिरिंज (छवि 1 ए, बी) की सुई पर हल्के से खींच . यह सुनिश्चित करता है कि सुई संयोजी ऊतक overlying में डाला जाता है और करता है लाल मांसपेशियों में ही सीधे नुकसान नहीं है. सुई सम्मिलित इतना है कि टिप लाल मांसपेशियों की दुम पहलू शामिल हैं.
- बहुत धीरे धीरे सही लाल पेशी पर समाधान इंजेक्षन जबकि सिरिंज वापस लेने के लिए शुरू, कुल इंजेक्शन समय लगभग 1 मिनट का होना चाहिए. अगर ठीक से इंजेक्शन, समाधान overlying त्वचा है कि कम से कम एक घंटे के लिए रहेगा में एक "गुंबद" है कि व्यास में लगभग 1 सेमी है, फार्म चाहिए. एक समान इंजेक्शन समाधान सही लाल की मांसपेशी के पूरे व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम क्षेत्रों को कवर किया जाएगा.
- प्रक्रिया दोहराएँ 1 से 7 दिनों के लिए हर 12 घंटे. अन्य studies1 के लिए, हम एक ही प्रोटोकॉल का इस्तेमाल वृद्धि कारकों को 21 दिनों के लिए हर 12 घंटे इंजेक्षन. कोई असामान्य प्रतिक्रियाओं 21 दिनों के लिए संज्ञाहरण 2x एक दिन के साथ प्रशासित चूहों से मनाया गया.
2. लाल मांसपेशियों के विच्छेदन
- Pentobarbital सोडियम की अधिक मात्रा (390 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों euthanize. मौत दिल की धड़कन की कमी का आकलन करने के बाद thoracotomy प्रदर्शन है द्वारा आश्वासन दिया है.
- एक विच्छेदन डिश में माउस नीचे पिन प्रत्येक पंजा में 1 पिन और नाक के माध्यम से 1 पिन के साथ पृष्ठीय पक्ष.
- केवल त्वचा के माध्यम से पहली चीरा बनाओ, छोटे वसंत कैंची का उपयोग के साथ सिर्फ बाएं कंधे ब्लेड के आसपास के क्षेत्र के लिए कान के लिए समीपस्थ क्षेत्र से बाईं लाल कटौती.
- ध्यान से इस क्षेत्र में त्वचा को हटा दें, लेकिन भी सही कान के लिए पास काटने के रूप में यह सही लाल पेशी के लिए अनुलग्नक के अंक में से एक है से बचने.
- Midline साथ केन्द्र तैनात वसा लिपिड का ऊतक पट्टी, सिर के ऊपरी सतह पर, जहां सही है और छोड़ दिया लाल मांसपेशियों को पूरा पता लगाएँ. छोटे वसंत कैंची का प्रयोग, कंधे (छवि 1C) तक पहुँचने तक बाईं लाल मांसपेशियों के समीपस्थ किनारे से वसा ऊतकों (बाएं कान की ओर) के अधिकार के लिए 1cm कटौती.
- एक बार चीरा, छील छोटे पेशी के ventral पक्ष का पर्दाफाश संदंश के साथ वापस सही लाल मांसपेशियों किया जाता है. जबकि सही लाल पेशी पर ध्यान संदंश (छवि 1C) के साथ खींच संयोजी ऊतक और प्रावरणी छाँटो .
- कान के आधार पर सही लाल की दुम अंत के आसपास कट. काटने, सही कान के व्याख्यान चबूतरे वाला अंत की ओर चलती है, सही लाल अधिक (छवि 1C) चालू रखने जारी रखें .. यह बेहतर है ही लाल हानिकारक जोखिम की तुलना में इस कदम पर और अधिक ऊतक शामिल. यदि मांसपेशियों बाहर सूखी, विंदुक 1X पीबीएस पेशी पर शुरू होता है.
- प्लेस 30mm संस्कृति Sylgard 1X Pbs, पृष्ठीय पक्ष युक्त पकवान में सही लाल dissected. छोटे कीट पिन के साथ नीचे की मांसपेशियों के चार कोनों पिन.
- सही लाल की मांसपेशी के पृष्ठीय और उदर सतहों से छोटे संदंश और वसंत कैंची, साफ संयोजी ऊतक का उपयोग करना. मांसपेशियों मोड़ पर है और फिर पिन क्रम में के लिए रवाना ventral सतह को साफ. 2-3 मांसपेशियों को एक ही 30mm डिश में रखा जा सकता है है.
3. लाल NMJs की ट्रिपल immunostaining: दिवस 1
- शुरुआत immunostaining से पहले, सभी आवश्यक अभिकर्मकों तैयार. , 2% गोजातीय सीरम albumin BSA 1X पीबीएस) / Pbs, 0.1M Glycine में 2% BSA / Pbs, 0.2% 2% / BSA, Pbs, और 1X पीबीएस में 4% (पीएफए) paraformaldehyde में ट्राइटन X100 की जरूरत होगी. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूर्व शांत मेथनॉल.
- लाल पकवान पृष्ठीय पक्ष में इस प्रक्रिया के दौरान टिकी मांसपेशियों को छोड़ दें. 1X पीबीएस समाधान त्यागें और पर्याप्त 4% (पीएफए) जोड़ने के लिए मांसपेशियों को कवर. हिलनेवाला पर प्लेस पकवान गति 2 या 3 में 20 मिनट के लिए निर्धारित किया है. जब तक अन्यथा नोट, पकवान निम्न चरणों के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखा होना चाहिए.
- 4% पीएफए त्यागें और 1X पीबीएस 3 बार, 10 प्रत्येक के साथ मांसपेशियों धोने.
- त्यागें धोने पिछले 1X पीबीएस और 0.1M Glycine में 2% जोड़ने के लिए 30 'BSA / पीबीएस समाधान.
- 0.1M Glycine समाधान एक त्यागेंघ जोड़ने के 1X पीबीएस 15 'के लिए 1:200 के एक एकाग्रता में rhodamine संयुग्मित α-bungarotoxin युक्त.
- Α-bungarotoxin समाधान त्यागें और 1X Pbs, 10 3 बार प्रत्येक में पेशी धोने.
- पूर्व ठंडा मेथनॉल जोड़कर ऊतक Permeabilize और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ठीक 5 मिनट के लिए पकवान जगह कोई जरूरत मिलाते हुए.
- मेथनॉल निकालें और 3 बार 10 1X पीबीएस के साथ प्रत्येक धोने. पिछले धोने और साथ ब्लॉक ऊतक त्यागें 0.2% Triton एक्स 100 / BSA पीबीएस 2% में 1 घंटे के लिए. धोने और अवरुद्ध चरणों कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं.
- मांसपेशियों को रातोंरात सेते हैं, मिलाते हुए, 4 बजे ° अवरुद्ध समाधान (cf., टैबिल) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के एक कॉकटेल में सी.
4. लाल NMJs की ट्रिपल immunostaining: 2 दिन
- 1X पीबीएस 3 बार, 10 'कमरे के तापमान पर प्रत्येक में मांसपेशियों को धो लें.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटा (cf., टेबल) के समाधान के लिए अवरुद्ध में माध्यमिक एंटीबॉडी के कॉकटेल जोड़ें. फोटो Alexa-Fluor 647 प्रतिदीप्ति के विरंजन रोकने मांसपेशियों को इस कदम से आगे प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए.
- 1X पीबीएस 3 बार, 10 प्रत्येक में मांसपेशियों को धो लें.
- 1X पीबीएस में किसी भी शेष संयोजी ऊतक को साफ़ करने के लिए, लाल मांसपेशियों के पार्श्व सीमा में कटौती और स्लाइड्स पर पृष्ठीय पक्ष माउंट, कांच के कवर फिसल जाता है और बढ़ते मीडिया का उपयोग करते हुए. स्पष्ट नेल पॉलिश का प्रयोग करने के लिए सुरक्षित जगह में कवर पर्ची.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और दुकान से विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक स्लाइड को सुरक्षित रखें.
5. लाल NMJs के Confocal इमेजिंग
- उच्च संकल्प confocal छवियों Leica टीसीएस 4D confocal खुर्दबीन पर एक Leica योजना ए पी ओ 63X तेल उद्देश्य (1.4NA) के साथ प्राप्त कर रहे हैं.
- Fluorescein और alexa 647 संकेतों को एक साथ लेजर 488 एनएम (आर्गन, 488 एनएम, 20 मेगावाट) लाइनों और 633 एनएम (HeNe, 633 एनएम, 10 मेगावाट) के साथ थे क्रमशः स्कैन. Sequentially, rhodamine संकेत तो लेजर लाइन के साथ 561 एनएम (DPSS, 561, 20 मेगावाट) को स्कैन है. ऑप्टिकल वर्गों 0.3 सुक्ष्ममापी अंतराल पर एकत्र किए गए थे, और z विमान में छवियों की संख्या 60-80 से विविध. pinhole एक हवादार (107.97 उम) के लिए निकाला जाता है. छवि 1024 प्रारूप 1024 x (एक्स, वाई), 1 के एक ज़ूम 234.32 x 234.32 सुक्ष्ममापी और 229.05 एनएम के पिक्सेल आकार x 229.05 एनएम सुक्ष्ममापी की एक छवि आकार में 400Hz गति परिणामों को कारक के साथ.
- Leica अधिग्रहण टीसीएस NT सॉफ्टवेयर तो अधिकतम तीव्रता के अनुमानों में z-श्रृंखला छवियों के पुनर्निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है.
- Multipanel छवियों चमक और विपरीत Adobe Photoshop का उपयोग करने के लिए समायोजित कर रहे हैं.
- एक ठेठ लाल मांसपेशियों के लिए, एक 75-100 लगभग एन चेहरे NMJs का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए. Synaptic स्थिरता पूर्व, पेरी और postsynaptic तत्वों के स्थानिक संरेखण (यानी, तंत्रिका, श्वान कोशिकाओं और मांसपेशियों) के रूप में सुविधाओं, और synaptic क्षेत्र की माप (यानी, synapse आकार) द्वारा निर्धारित किया जाता है.
प्रतिनिधि परिणाम:
एक एकल मांसपेशी फाइबर, ठीक निकोटिनिक AChRs के postsynaptic समूहों (लाल, छवि 2) के लिए apposed पर, वयस्क स्तनधारी NMJ से कम, एक एकल मोटर अक्षतंतु ठीक शाखाओं कि एक तंत्रिका टर्मिनल के अत्यधिक विभेदित arbors (ग्रीन छवि 2) के रूप में बताते . Perisynaptically, टर्मिनल श्वान कोशिकाओं कसकर presynaptic तंत्रिका टर्मिनलों की सभी शाखाओं (ब्लू, छवि 2) को कवर किया. इस त्रिपक्षीय संगठन के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता subtype विशेष mAChR inhibitors के दैनिक आवेदन द्वारा बुरी तरह परेशान है. उदाहरण यहाँ प्रस्तुत (3 छवि), 4 नम, M1, एम 3, M4 और M5 mAChR उपप्रकारों के लिए उच्च आत्मीयता के साथ एक mAChR प्रतिपक्षी, मांसपेशियों की सतह भर में कई NMJs से तंत्रिका टर्मिनलों के चयनात्मक उन्मूलन (छवि 3B उदाहरण भी देते हैं, सी). इसके अलावा, टर्मिनल श्वान कोशिकाओं असामान्य मौन हैं 8 प्रक्रिया एक्सटेंशन के बिना उज्ज्वल S100 लेबलिंग (छवि 3B, 3C ") द्वारा evidenced के रूप में. Postsynaptically, मांसपेशी फाइबर सामान्य हैं और वहाँ nAChRs का कोई नुकसान नहीं (छवि 3B, 3C ') है.
चित्रा 1 शारीरिक और लाल मांसपेशियों के स्थान संगठन. (RLAL) व्याख्यान चबूतरे वाला दुम (cLAL), और लाल (LALn) तंत्रिका और इसी endplate बैंड के स्थान (एक इनसेट,) दिखाए जाते हैं. स्थान और लाल मांसपेशियों के संबंध में सुई के उन्मुखीकरण इंजेक्शन प्रक्रिया (बी) के लिए दिखाया गया है. चीरा अंक विच्छेदन प्रक्रिया (सी) के लिए दिखाए जाते हैं.
चित्रा 2 NMJ की त्रिपक्षीय संगठन. एक माउस NMJ के उच्च बढ़ाई confocal देखा गया. एक एकल अक्षतंतु ठीक टर्मिनल (ए) शाखाओं, कस टर्मिनल श्वान सेल और उनकी प्रक्रियाओं की (ए ', तारांकनों टर्मिनल श्वान सेल शरीर को इंगित) के द्वारा कवर किया बताते हैं. Postsynaptically एक मांसपेशी फाइबर में, निकोटिनिक AChRs के एक क्लस्टर ठीक तंत्रिका termi की शाखाओं के लिए apposed हैnals और टर्मिनल श्वान कोशिकाओं.
चित्रा 3 लाल मांसपेशियों 4-नम, एक mAChR विरोधी के साथ इलाज किया . लाल मांसपेशियों की कम और उच्च बढ़ाई confocal दृश्य वाहन या 4 - नम के साथ इलाज किया. वाहन इलाज मांसपेशियों (ए 4 नम इलाज मांसपेशियों कमी तंत्रिका (टर्मिनलों में'''), कई NMJs के विपरीत बी बी ''', सी - सी'''). चित्रा 2B में एक बॉक्सिंग क्षेत्र चित्रा 2C में तेजी से बढ़ी है.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि subtype विशेष स्तनधारी NMJs की स्थिरता और रखरखाव में संकेत mAChR के पहले से अपरिचित भूमिका की जांच परमिट. इस विधि भी उपयोगी हो neurotrophic कारकों और औषधीय एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करेंगे. उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला में पाया गया कि सिलिअरी neurotrophic कारक (CNTF) वयस्क चूहों में लगभग सभी लाल तंत्रिका टर्मिनलों से अंकुरण हासिल 1. इस परिणाम CNTF इलाज हिंद अंग की मांसपेशियों, जो उदारवादी बताया ca में अंकुरण के पूर्व अध्ययन के साथ विषम. Gluteus और पार्श्व gastrocnemius 3 जंक्शनों के 9% से कम 13-33% . हमें विश्वास है कि विसंगति अधिक वर्दी और लंबे समय तक तंत्रिका टर्मिनलों के पिछले अंग की मांसपेशियों की तुलना में लाल में CNTF के लिए जोखिम के लिए कारण था. दरअसल, जब हम CNTF पार्श्व gastrocnemius और tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों का उपयोग एक ही प्रोटोकॉल है कि लगभग सभी लाल NMJs से बड़े पैमाने पर अंकुरण हासिल करने के लिए लागू है, हम NMJs है कि preferentially इंजेक्शन साइटों के पास स्थित था की केवल एक मामूली संख्या से कमजोर अंकुरण मनाया. जाहिर है, hindlimb NMJs CNTF के लिए जोखिम सीमित है और असमान किया गया था, के रूप में भी पिछले एक अध्ययन में उल्लेख किया 2 . दूसरी ओर, CNTF subdermal संयोजी ऊतक और लाल प्रावरणी के बीच इंजेक्शन, लेकिन पिछले अंग की मांसपेशियों में subcutaneously CNTF इंजेक्शन नहीं, एक स्थानीय, subdermal सूजन है कि संवहनी reabsorption से पहले कम से कम एक घंटे के लिए बनी गठन. यह भी उल्लेखनीय है कि जब भी CNFT या mAChR विरोधी के इंजेक्शन आवृत्ति बढ़ा दिया गया था चार बार दैनिक, हम विशेष रूप से CNTF और mAChR विरोधी के additive प्रभाव का पालन नहीं किया है. इसके अलावा, अगर इंजेक्शन प्रक्रिया प्रदर्शन उचित है, यह संभावना नहीं है कि किसी भी प्रत्यक्ष मांसपेशियों की क्षति घटित होता है. हालांकि, अगर एक इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान मांसपेशियों की क्षति, तंत्रिका टर्मिनल पर या नोड्स पर axonal अंकुरण, और / या मांसपेशी फाइबर अध: पतन 1,8 मनाया जा सकता है . संक्षेप में, लाल मांसपेशियों एक अद्वितीय तैयारी है कि अपेक्षाकृत आसान है और जल्दी प्रक्रियाओं के साथ एक मांसपेशी के भीतर वर्दी सभी NMJs के लंबे समय तक निवेश परमिट हैं.
संकरा एक लाल मांसपेशियों की दुम भाग व्यापक व्याख्यान चबूतरे वाला भाग (मोटी 2-3 मांसपेशी फाइबर) से अधिक गहरा (3-5 मांसपेशियों मोटी फाइबर) है. तदनुसार, NMJs मांसपेशी फाइबर गहरा लाल दुम में तैनात के साथ जुड़े अक्सर या तो लेबल रहे हैं wholemount immunostaining में नहीं या α-bungarotoxin है, जो अपने छोटे आकार और nAChRs के लिए उच्च संबंध के कारण एंटीबॉडी की तुलना में अधिक गहराई से प्रवेश द्वारा ही लेबल. ये NMJs खो तंत्रिका टर्मिनलों या श्वान लागू दवाओं के विशिष्ट प्रभाव के कारण कोशिकाओं होने के रूप में misinterpreted किया जा सकता है है. इसलिए यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि इन जंक्शनों केवल दुम LAL में मनाया जाता है, और चाहे NMJs या मांसपेशी फाइबर अल्पज्ञता या गहरा तैनात हैं: अल्पज्ञता तैनात मांसपेशी फाइबर आमतौर पर बहुत अधिक गहरा तैनात फाइबर की तुलना पृष्ठभूमि immunofluorescence के साथ जुड़े रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, एक गहरा wholemount विश्लेषण से लाल की दुम पट्टी में तैनात NMJs छोड़ सकते हैं.
हालांकि लाल नसों की पूरी transection अपेक्षाकृत आसान है और हमें denervated मांसपेशियों पर mAChR निषेध के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी है, और लाल नसों के आकार और पहुंच शल्य दृष्टिकोण है कि जांच की जा सकता है के प्रकार सीमा. उदाहरण के लिए, आंशिक रूप से लाल तंत्रिका हानिकारक तकनीकी क्रम में एक लाल मांसपेशियों की आंशिक denervation प्रेरित लगता है काफी चुनौतीपूर्ण है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम पेशी Dystrophy एसोसिएशन, एनआईएच, (NS062320) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
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