Summary
Vi beskriver förfaranden för upprepad administrering av hämmare av muskarina signalerar till levator auris longus (LAL) muskler för unga vuxna möss och för efterföljande immunfärgning av neuromuskulära korsningar (NMJs) i wholemounts. Lal muskeln har unika fördelar för att avslöja
Abstract
Bakbenen muskler av gnagare, såsom gastrocnemius och tibialis anterior, används ofta för in vivo-farmakologiska studier av signaler viktiga för bildandet och underhållet av däggdjur NMJs. Det är dock drog inträngande i dessa muskler efter subkutan eller intramuskulär administrering ofta ofullständiga eller ojämn och många NMJs kan inte påverkas. Även systemisk behandling med enheter som mini-pumpar kan förbättra Spatiotemporal effekter, kan invasiv art detta tillvägagångssätt leda till felkällor inflammatoriska reaktioner och / eller direkt muskelskada. Dessutom är fullständig analys av NMJs i bakbenen muskel utmanande eftersom det kräver tidskrävande seriell sektionering och omfattande immunfärgning.
Musen LAL är en tunn, platt ark muskeln ligger ytligt på dorsum av halsen. Det är en snabbt muskelfibrerna som fungerar för att flytta ytterörat. Den innehåller rostralt och stjärtfenan delar som kommer från mittlinjen av kraniet och utöka sidled till brosk del av varje ytterörat. Muskeln tillhandahålls av en gren av ansiktsnerven att projekt caudally när det lämnar stylomastoid foramen. Vi och andra har funnit LAL vara en bekväm beredning som erbjuder fördelar för utredning av både kort-och långsiktiga in vivo effekter av läkemedel på NMJs och muskler. Först underlättar dess ytliga läge flera lokala tillämpningar av narkotika i lätt narkos. För det andra medger dess tunn (2-3 lager av muskelfibrer) visualisering och analys av nästan alla NMJs i muskeln. Tredje, tillåter enkel dissekera den med sitt Nerve intakt tillsammans med mönstret för sin innervation kompletterande elektrofysiologiska analys in vitro 9,5. Sist, och kanske viktigast, täcker en liten tillämpas volym (~ 50μl) enkelt hela muskeln yta, ger en enhetlig och långvarig exponering av alla dess NMJs på läkemedlet och eliminerar behovet av en systematisk strategi 1,8.
Protocol
1. Subkutan administrering av muskarina (mAChR) acetylkolin receptor antagonister
- Förbered under aseptiska förhållanden lämplig dos av mAChR antagonist, (jfr tabell) genom att lösa upp läkemedlet i steril fysiologisk koksaltlösning i 1,5 mL reaktionsrör. Följande antagonister har använts: atropin, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Rita 50μl lösning i a1cc insulin spruta och använda en separat spruta för varje mus. Också förbereda sprutor innehållande fysiologisk koksaltlösning enbart för varje mus i kontrollgruppen. Håll sprutor på is tills redo att injicera.
- Bedöva möss med ketamin-xylazin cocktail (120 mg / kg ketamin, 8 mg / kg xylazin) Kontrollera för lämplig anestesi djup genom att observera bristande respons på tå nypa.
- Efter korrekt sedering, raka håret som täcker rostralt region i huvudet till den bakre regionen av halsen, torka återstående håret bort med 70% etanol.
- Placera musen i stereomikroskop och sätter nålen parallellt med LAL muskler samtidigt som du drar upp lätt på nålen på sprutan (bild 1A, B). Detta säkerställer att nålen sätts in i överliggande bindväv och inte direkt skadar LAL muskeln själv. Sätt nålen så att spetsen täcker caudal aspekt av LAL muskeln.
- Mycket långsamt börjar injicera lösning över den högra LAL muskler samtidigt dra tillbaka i sprutan, den totala injektionen tid bör vara ungefär 1 minut. Om injiceras korrekt bör lösningen bildar en "dome" som är ungefär 1 cm i diameter, i den överliggande huden som kommer att förbli i minst en timme. Ett enhetligt injicerade lösningen kommer att täcka hela rostralt och caudal regioner rätt LAL muskeln.
- Upprepa proceduren var 12 timmar för 1 till 7 dagar. För andra studier1 använde vi samma protokoll för att injicera tillväxtfaktorer var 12 timmar för upp till 21 dagar. Inga onormala reaktioner observerades från möss ges med anestesi 2x per dag i upp till 21 dagar.
2. Dissekering av LAL muskler
- Euthanize möss med en överdos av natrium pentobarbital (390 mg / kg). Döden är säkerställd genom bedömning av avsaknaden av hjärtslag efter torakotomi utförs.
- Pin ner musen i en dissektion maträtt, ryggsidan upp med ett stift i varje tass och ett stift genom näsan.
- Gör den första snitt genom huden enbart med hjälp av små fjäder sax för att klippa längs vänstra LAL från regionen strax proximalt örat till regionen runt vänstra skulderbladet.
- Ta försiktigt bort skinnet i denna region, men undvika att skära för nära det högra örat eftersom detta är en av de fästpunkter för rätt LAL muskeln.
- Leta reda på den centralt placerade band fettväv av lipid längs mittlinjen, på den ytliga ytan av huvudet, där höger och vänster LAL muskler möts. Med små våren saxar, skär 1 cm till höger om fettvävnad (mot vänster öra) från den proximala kanten av den vänstra LAL muskeln tills de når axeln (bild 1C).
- När snitt görs, skal tillbaka rätt LAL muskeln med små pincett för att exponera den ventrala sidan av muskeln. Trimma bindväv och fascia samtidigt försiktigt dra upp till höger LAL muskeln med pincett (Figur 1C).
- Skär runt den bakre änden av rätt LAL vid basen av örat. Fortsätt skärning, rör sig mot rostralt slutet av höger öra, hålla rätt LAL vänds (bild 1C).. Det är bättre att inkludera fler vävnaden vid detta steg än att riskera att skada LAL själv. Om muskeln börjar torka ut, pipett 1X PBS över muskeln.
- Placera dissekerade rätt LAL i 30mm kultur Sylgard maträtt som innehåller 1X PBS, ryggsidan uppåt. Pin ner fyra hörnen av muskler med små insekter stift.
- Med små pincett och sax våren, ren bindväv från dorsala och ventrala ytor av rätt LAL muskeln. Vänd muskel om och om igen pin för att rensa bort ventrala yta. 2-3 muskler får placeras i samma 30mm skålen.
3. Triple immunfärgning av LAL NMJs: Dag 1
- Innan du börjar immunfärgning, förbereda alla nödvändiga reagenser. 1X PBS, 2% bovint serumalbumin BSA) / PBS, 0,1 miljoner Glycine hos 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 hos 2% BSA / PBS, och 4% paraformaldehyd (PFA) i 1X PBS kommer att behövas. Pre-cool metanol i -20 ° C frys.
- Lämna LAL muskler nålas i skålen ryggsidan upp under denna process. Kassera 1X PBS lösning och tillsätt tillräckligt 4% (PFA) för att täcka muskeln. Placera skålen på skakapparat hastighet 2 eller 3 i 20 minuter. Om inget annat anges, bör skålen placeras på en shaker för de följande stegen.
- Kasta 4% PFA och tvätta muskeln med 1X PBS 3 gånger, 10 'vardera.
- Kassera senaste 1X PBS tvätta och lägga 0,1 miljoner Glycine i 2% BSA / PBS lösning för 30 ".
- Kasta 0,1 miljoner Glycine lösningen enD Lägg 1X PBS innehållande Rhodamine konjugerad α-bungarotoxin vid en koncentration av 1:200 för 15 ".
- Kasta α-bungarotoxin lösning och tvätta muskler i 1X PBS, 3 gånger 10 "var.
- Permeabilize vävnad genom att lägga nedkylda metanol och placera skålen i -20 ° C frys för just 5 minuter, inga skakningar behövs.
- Ta bort metanol och tvätta tre gånger 10 "var och en med 1X PBS. Kasta sista tvättningen och blockerar vävnad med 0,2% Triton X-100 hos 2% BSA / PBS i 1 timme. Tvätten och blockering stegen utförs i rumstemperatur.
- Inkubera musklerna över natten, skaka, vid 4 ° C i en cocktail av primära antikroppar späds ut i den blockerande lösningen (jfr tabell).
4. Triple immunfärgning av LAL NMJs: Dag 2
- Tvätta muskler i 1X PBS 3 gånger, 10 'vardera vid rumstemperatur.
- Lägg cocktail av sekundära antikroppar i blockerande lösningen i 1 timme i rumstemperatur (se tabell). Musklerna måste skyddas från ljus från detta steg framåt för att förhindra att foto-blekning av Alexa-Fluor 647 fluorescens.
- Tvätta muskler i 1X PBS 3 gånger, 10 'vardera.
- Rengör bort eventuell kvarvarande bindväven i 1X PBS, skär den laterala gränser LAL muskler och montera på diabilder ryggsidan uppåt, med glas cover-halk och montering medier. Använd genomskinligt nagellack för att säkra locket glida på plats.
- Skydda bilder från ljus och förvaras vid -20 ° C tills för analys.
5. Konfokal avbildning av LAL NMJs
- Högupplösta konfokala bilder erhålls med en Leica Plan Apo 63x olja mål (1.4NA) på en Leica TCS 4D konfokalmikroskop.
- Fluorescein och Alexa 647 signalerna samtidigt scannas med laser linjerna 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) och 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respektive. Jämfört med föregående kvartal är Rhodamine signal sedan skannas med lasern linje 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Optisk sektioner samlades in vid 0,3 ìm intervall och antalet bilder i z-planet varierade från 60 till 80. Den Pinhole anpassas till Airy 1 (107,97 um). Bildformatet 1024 x 1024 (X, Y), med en zoomfaktor 1, vid 400Hz fart ger en bildstorlek på 234,32 ìm x 234,32 ìm och pixelstorlek på 229,05 nm x 229,05 nm.
- Leica TCS-NT förvärvet programvara används sedan för att rekonstruera z-serie bilder till maximal intensitet prognoser.
- Multipanel bilder är justerade för ljusstyrka och kontrast med hjälp av Adobe Photoshop.
- För en typisk LAL muskel ska man kunna analysera cirka 75-100 En Face NMJs. Synaptic stabilitet bestäms genom funktioner som fysisk anpassning av pre-, peri-och postsynaptiska element (dvs. nerv, Schwann celler och muskler) och mätningar av synaptiska område (dvs. synapserna storlek).
Representativa resultat:
På vuxna däggdjur NMJ, utvecklar en motor axon fina grenar som bildar mycket differentierad Arbors av en nerv terminal (Fig. 2, Grön) på en enda muskelfiber, just apposed till postsynaptiska kluster av nikotinsyra AChRs (Fig. 2, Röd) . Perisynaptically, terminal Schwann celler täcker väl alla grenar av presynaptiska nervterminaler (Fig. 2, Blå). De strukturella och funktionella integritet här tre parter organisation är allvarligt störs av dagliga tillämpningen av subtyp-specifika mAChR hämmare. I exemplet som presenteras här (Fig. 3), väcker 4-DAMP, ett mAChR antagonist med hög affinitet för M1, M3, M4 och M5 mAChR subtyper, selektiv eliminering av nervterminaler från många NMJs hela muskeln ytan (Fig. 3B, C). Dessutom terminal Schwann celler är onormalt vilande 8, vilket framgår av ljusa S100 märkning utan processen förlängning (Fig. 3B ", 3C"). Postsynaptically, muskelfibrer är normala och det finns ingen förlust av nAChRs (Fig. 3B, 3C).
Figur 1. Anatomiska läge och organisation av LAL muskeln. Placering av rostralt (rLAL), stjärtfenan (clal) och LAL nerven (LALn) och motsvarande band ändplattan visas (A, infälld). Placeringen och orienteringen av nålen i förhållande till LAL muskeln visas för injektionen (B). Snitt poäng visas för dissekering förfarande (C).
Figur 2. Trepartiska organisation av NMJ. Hög förstoring konfokala vyer av en mus NMJ. En enda axon utvecklar fina terminalen grenar (A), tätt omfattas av terminalen schwanncell och deras processer (A ', asterisker peka på terminalen schwanncell organ). Postsynaptically i en muskel fiber, är ett kluster av nikotinsyra AChRs exakt apposed till grenar av nerv termiterminaler och terminal Schwann celler.
Figur 3. LAL musklerna behandlas med 4-DAMP, ett mAChR antagonist. Låg-och hög förstoring konfokala vyer av LAL muskler behandlas med fordon eller 4-DAMP. I motsats till fordonet behandlade muskeln (A-A'''), många NMJs i 4-DAMP-behandlade nerv muskel saknar terminaler (B-B''', C-C'''). En förpackade område i figur 2B zoomas i figur 2C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här tillåter undersökning av tidigare okänd roller av subtyp-specifika mAChR signalering i stabilitets-och underhåll av däggdjur NMJs. Denna metod kommer också att vara användbar för att testa effekterna av neurotrofa faktorer och farmakologiska agenter. Till exempel, hittade vårt laboratorium som ciliär Neurotrophic Factor (CNTF) framkallade groning från nästan alla LAL nervändslut i vuxna möss 1 . Detta resultat jämförs med tidigare studier av CNTF behandlade bakbenen muskler, som rapporterade måttlig groning vid ca. 13-33% av gluteus och till 9% av laterala gastrocnemius korsningar 3. Vi tror att skillnaden berodde på en mer enhetlig och långvarig exponering av nervterminaler till CNTF i LAL än i bakbenen muskler. Det är när vi tillämpade CNTF mot laterala gastrocnemius och tibialis anterior muskulaturen använder samma protokoll som framkallat omfattande groning från nästan alla LAL NMJs noterade vi en svag groning från endast ett blygsamt antal NMJs som företrädesvis fanns nära injektionsställen. Tydligen hade exponeringen av bakbenen NMJs att CNTF varit begränsad och ojämn, som också noterades i en tidigare studie 2 . Å andra sidan, CNTF injiceras mellan subdermal bindväv och LAL fascia, men inte CNTF injiceras subkutant i bakbenen muskler, bildade en lokal, subdermal svullnad som kvarstod i minst en timme före vaskulär reabsorption. Det är också anmärkningsvärt att även om injektionen frekvensen av CNFT eller mAChR antagonister ökade till upp till fyra gånger dagligen, har vi inte iakttar särskilt additiva effekter av CNTF och mAChR antagonister. Dessutom, om injektionsproceduren utförs på rätt sätt, är det osannolikt att någon direkt muskelskada skulle inträffa. Men om man gjorde skada i muskeln under injektionen, axonal groning på nerven terminalen eller på noder och / eller muskelfiber degenerering kunde observeras 1,8. Sammanfattningsvis LAL muskler är en unik förberedelse som tillåter enhetlig, långvarig exponering av alla NMJs inom en muskel med relativt enkla och snabba förfaranden.
Den smalare caudal del av en LAL muskel är tjockare (3-5 muskelfibrer tjock) än den större rostralt delen (2-3 muskelfibrer tjock). Därför är NMJs förknippade med muskelfibrer djupt placerade i stjärtfenan LAL ofta antingen inte är märkt i wholemount immunfärgning eller märks endast av α-bungarotoxin som tränger djupare än antikroppar på grund av sin mindre storlek och hög affinitet för nAChRs. Dessa NMJs kan misstolkas som att ha förlorat nervändar eller celler Schwann på grund av specifika effekter av tillämpade droger. Det är därför viktigt att notera om dessa korsningar bara observerats i caudal LAL, och om NMJs eller muskelfibrer är ytligt eller djupt placerade: är ytligt placerade muskelfibrer som vanligtvis förknippas med mycket högre bakgrunden immunofluorescens än djupt placerade fibrer. Alternativt kan man utelämna djupt placerade NMJs i caudal remsa av LAL från wholemount analys.
Även komplett transection av LAL nerver är relativt lätt och möjligt för oss att studera effekterna av mAChR hämning på denervated muskler, storlek och tillgänglighet av LAL nerver begränsa antalet typer av kirurgiska metoder som kan undersökas. Till exempel, delvis skada LAL nerv i syfte att förmå delvis denervering av LAL muskel förefaller detta tekniskt ganska utmanande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av muskeldystrofi Association, NIH (NS062320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
