Vi beskriver ett protokoll för att identifiera viktiga roller värd signalmolekyler i lytisk replikering av en modell herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Använda genetiskt modifierade musstammar och embryonala fibroblaster för γHV68 lytisk replikering tillåter protokollet både fenotypiska karaktärisering och molekylär förhör av virus-värd interaktioner i viral lytisk replikering.
Som svar på viral infektion, utvecklar en värd olika defensiva svar, såsom aktivering medfödda immunförsvaret signalvägar som leder till antivirala cytokinproduktion 1,2. För att kolonisera värden, virus är obligat att undgå värdens antivirala svar och manipulera signalvägar. Reda ut värd-virus interaktion kommer att belysa utvecklingen av nya terapeutiska strategier mot virusinfektion.
Murin γHV68 är nära besläktat med människans onkogen Kaposis sarkom-associerat herpesvirus och Epsten-Barr-virus 3,4. γHV68 infektion i laboratoriemöss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka hela förlopp värd svar och virusinfektion in vivo som inte är tillgängliga för humana herpesvirus. I detta protokoll presenterar vi en panel av metoder för fenotypisk karaktärisering och molekylär dissekering av värd signalering komponenter i γHV68 lytisk replication både in vivo och ex vivo. Tillgången på genetiskt modifierade musstammar tillåter förhör av roller vägar värd signalering under γHV68 akut infektion in vivo. Dessutom kan mus embryonala fibroblaster (MEF) isolerades från dessa bristfälliga musstammar användas för att ytterligare dissekera roller dessa molekyler under γHV68 lytisk replikering ex vivo.
Använda virologiska och molekylärbiologiska analyser kan vi lokalisera den molekylära mekanismen av värd-virus interaktion och identifiera värd och virala gener nödvändiga för viral lytisk replikering. Slutligen underlättar en bakteriell artificiell kromosom (BAC)-system införande av mutationer i den virala faktor (er) som specifikt avbryter värd-viruset interaktion. Rekombinant γHV68 bär dessa mutationer kan användas för att sammanfatta de fenotyper av γHV68 lytisk replikering i MEF brist på central värd signalering komponenter.Detta protokoll ger en utmärkt strategi för att förhöra värd-patogen interaktion på flera nivåer för ingripande in vivo och ex vivo.
Nyligen har vi upptäckt att γHV68 inkräktar en medfödda immunförsvaret signalvägen för att främja viral lytisk replikering 5. Specifikt aktiverar γHV68 de novo infektion immunförsvaret kinas IKKβ och aktiverat IKKβ fosforylerar befälhavaren viral transkriptionsfaktor, replikering och transaktivator (RTA), för att främja viral transkriptionsaktivering. På så γHV68 effektivt kopplar sin transkriptionsaktivering att vara värd medfödda immunförsvaret aktiveras och därigenom underlätta viral transkription och lytisk replikering. Denna studie är ett utmärkt exempel som kan tillämpas på andra virus att förhöra värd-virus interaktion.
Som svar på viral infektion, de Mavs beroende medfödda immunförsvaret signaleringsvägar aktiveras för att främja produktionen av antivirala inflammatoriska cytokiner 10-14. Använda mus γHV68 som en modell virus för human onkogen Kaposis sarkom-associerat herpesvirus och Epstein-Barr-virus 3,4, upptäckte vi att γHV68 inkräktar Mavs-IKKβ Pathway to främja viral lytisk replikering via transkriptionsaktivering 5. Använda genetiskt modifierade MEF och tekniker inom molekylär v…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, molekylärbiologi) för att tillhandahålla nödvändiga reagenser, inklusive Mavs – / – möss och Dr Ren Sun (University of California-Los Angeles, farmakologi och molekylär medicin ) för att tillhandahålla den bakteriella artificiella kromosom av γHV68 för denna studie.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
Methylcellulose | Sigma | M0512 |
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |