Analysera Host-virus interaktion i Lytisk Replikering av en modell Herpesvirus

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att identifiera viktiga roller värd signalmolekyler i lytisk replikering av en modell herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Använda genetiskt modifierade musstammar och embryonala fibroblaster för γHV68 lytisk replikering tillåter protokollet både fenotypiska karaktärisering och molekylär förhör av virus-värd interaktioner i viral lytisk replikering.

Abstract

Som svar på viral infektion, utvecklar en värd olika defensiva svar, såsom aktivering medfödda immunförsvaret signalvägar som leder till antivirala cytokinproduktion ^1,2. För att kolonisera värden, virus är obligat att undgå värdens antivirala svar och manipulera signalvägar. Reda ut värd-virus interaktion kommer att belysa utvecklingen av nya terapeutiska strategier mot virusinfektion.

Murin γHV68 är nära besläktat med människans onkogen Kaposis sarkom-associerat herpesvirus och Epsten-Barr-virus ^3,4. γHV68 infektion i laboratoriemöss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka hela förlopp värd svar och virusinfektion in vivo som inte är tillgängliga för humana herpesvirus. I detta protokoll presenterar vi en panel av metoder för fenotypisk karaktärisering och molekylär dissekering av värd signalering komponenter i γHV68 lytisk replication både in vivo och ex vivo. Tillgången på genetiskt modifierade musstammar tillåter förhör av roller vägar värd signalering under γHV68 akut infektion in vivo. Dessutom kan mus embryonala fibroblaster (MEF) isolerades från dessa bristfälliga musstammar användas för att ytterligare dissekera roller dessa molekyler under γHV68 lytisk replikering ex vivo.

Använda virologiska och molekylärbiologiska analyser kan vi lokalisera den molekylära mekanismen av värd-virus interaktion och identifiera värd och virala gener nödvändiga för viral lytisk replikering. Slutligen underlättar en bakteriell artificiell kromosom (BAC)-system införande av mutationer i den virala faktor (er) som specifikt avbryter värd-viruset interaktion. Rekombinant γHV68 bär dessa mutationer kan användas för att sammanfatta de fenotyper av γHV68 lytisk replikering i MEF brist på central värd signalering komponenter.Detta protokoll ger en utmärkt strategi för att förhöra värd-patogen interaktion på flera nivåer för ingripande in vivo och ex vivo.

Nyligen har vi upptäckt att γHV68 inkräktar en medfödda immunförsvaret signalvägen för att främja viral lytisk replikering ^5. Specifikt aktiverar γHV68 de novo infektion immunförsvaret kinas IKKβ och aktiverat IKKβ fosforylerar befälhavaren viral transkriptionsfaktor, replikering och transaktivator (RTA), för att främja viral transkriptionsaktivering. På så γHV68 effektivt kopplar sin transkriptionsaktivering att vara värd medfödda immunförsvaret aktiveras och därigenom underlätta viral transkription och lytisk replikering. Denna studie är ett utmärkt exempel som kan tillämpas på andra virus att förhöra värd-virus interaktion.

Protocol

1. Mus infektion med γHV68

1. Sex till åtta veckor gamla, könsmatchad kullsyster möss (8 till 12 möss / grupp) används för virusinfektion. Låt möss att acklimatisera över fyra hela dagar (96 timmar) efter leverans.
2. Protokoll steg med hjälp viruset bör utföras i ett skåp i skyddsnivå 2 (BSL2) med vanliga BSL2 försiktighetsåtgärder.
3. Bered virussuspension (40 till 1 x 10 ⁵ plackbildande enheter [PFU]) av γHV68 i 30 pl sterilt PBS per mus strax före experimentet. Håll virussuspension på is.
4. Bered ketamin / xylazin lösning (1,5 mg ketamin och 0,15 mg xylazine/20 g kroppsvikt, 100 pl / mus) för mus sedering. Se till att mössen har lugnande genom att utföra en tå nypa.
5. Stillsamma möss med 1,5 mg ketamin och 0,15 mg xylazin per 20 mg kroppsvikt (100 pl / mus) genom intra-peritoneal injektion.
6. Leverera virussuspension (30 ul / mus) intranasalt i en droppvismode, till en näsborre av sederade mössen.
7. Lay möss på ena sidan för 5 - 10 minuter för att underlätta luftvägarna leverans av viruset in i lungan.
8. Placera möss tillbaka i buren och övervaka möss tills de har återhämtat sig helt från sedering.
9. Vid olika dagar efter infektion, offra möss av CO ₂ kvävning och skörd lungorna efter att ha förvissat död / förlust av djup medvetslöshet. Placera lungor till sterila 1,5 ml med skruvkork rör innehållande 500 ul 1,0 mm Zirconia / Silica pärlor. Håll rören på is. Förvara proverna vid -80 ° C om inte avancera till nästa steg på samma dag. Mjälten eller levern vävnad kan samlas vid denna tidpunkt för analys av virus latens beroende på tidsramen för experiment.
10. Tillsätt 1 ml av kall serumfritt DMEM i röret och homogenisera lungorna genom pärl-slog 30 sekunder. Chill rören på is under minst 1 min. Upprepa denna process en gång.
11. Centrifugera lunga lysaten vid 16.000 ref vid 4 ° C under 1 min och använd supernatant bestämma virustiter av en plackanalys med hjälp av en NIH3T3 eller BHK21 monolager (se avsnitt 5 för detaljer).

2. Bestäm γHV68 flera steg tillväxten kinetik i mus embryonala fibroblaster

1. Grow vildtyp mus embryonala fibroblaster (MEF) och de saknar en värdgen till sub-konfluent (ca 80%) densitet före plätering celler.
2. Split MEF i 24-brunnars platta vid 10.000 celler / brunn för en låg multipilicity-av-infektion (MOI) på dagen före infektion. Experiment genomförs normalt i triplikat och vid en MOI mellan 0,001 till 0,05 används vanligen.
3. Bered γHV68 suspension innehållande önskad mängd virus (0,5 ml per brunn).
4. Avlägsna medium och täcka MEF med 0,5 ml γHV68 suspension per brunn.
5. Inkubera plattan i vävnadskultur inkubator, vagga varje 30 min, och låta inkubation fortsätta under 2 timmar.
6. Ta virussuspension, och täck celler med 0,5 ml färsk complete DMEM-medium innehållande 8% fetalt bovinserum.
7. Vid olika dagar efter infektion, skörda mediet och cellerna i sterila 1,5 ml centrifugrör. Omedelbart frysa rören vid -80 ° C.
8. Släpp γHV68 från MEF genom frysning vid -80 ° C, upptining i 37 ° C vattenbad och virvling. Tre cykler av frysning och upptining vanligen tillämpas på proverna.
9. Bestäm virustiter av en plackanalys med hjälp av en NIH3T3 eller BHK21 monolager (se avsnitt 5 för detaljer).
10. Läs virustiter och tomt γHV68 flera steg tillväxtkurva på MEF.

3. Molekylär dissektion av γHV68 lytisk replikation i mus embryonala fibroblaster

1. Utför virusinfektion som beskrivs i steg från 2,1 till 2,6 i avsnitt 2.
2. Vid olika dagar efter infektion, kassera supernatanten. Skölj celler med kall PBS och Trypsinisera celler. Pelletera celler genom centrifugering vid 1.000 RCF vid rumstemperatur under 1 min. Kasta bort supernatanten ochlagra celler vid -80 ° C.
3. Utdrag totala DNA (värd och virusgenom) och totalt RNA enligt tidigare publicerade metoder ^5,6.
4. Utför realtids-PCR med totalt DNA och primers specifika för virala lytiska avskrifter, såsom RTA (ORF50), ORF57 och ORF60. Bestämma den relativa mängden av intracellulär γHV68 genomet i förhållande till en värd housekeeping-gen (t.ex., β-aktin).
5. För att avlägsna genomiskt DNA kontaminering, är behandling med RNas-fritt DNas kritisk för cDNA-beredning med total-RNA och oligo (dT) _11-19 primer. Se referens 5 för mer information om RNA extraktion, inklusive behandling med RNas-fritt DNas och RT-PCR. Utför realtids-PCR med användning av cDNA och primers såsom ovan för att bestämma den relativa mängden av virala transkript med hänvisning till den för värdens housekeeping-gen.

4. Generera rekombinant γHV68 med bakteriell artificiell kromosom

Den metodd beskrivs här används för att introducera mutationer i en γHV68 gen som är involverad i värd-virus interaktion.

1. Förbered ett DNA-fragment (ca 1,5 kb) av vild-typ-sekvensen eller sekvens bär önskade mutationer i den centrala regionen genom PCR.
2. Förbered bakteriell artificiell kromosom (BAC) som innehåller en transposoninfogning ⁷ runt mutationsstället, som specifikt inaktiverar genen genen av intresse, genom midi skala rening (OriGene). Förvara BAC-DNA vid 4 ° C (undvik frysning / upptining av BAC-DNA).
3. Transfektera BAC-DNA och PCR-produkt som innehåller önskade mutationer av genen av intresse in i celler (t.ex. NIH3T3 eller BHK21), som är mycket tolerant till γHV68 lytisk replikering, med Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. Håll dela cellerna tills cytopatisk effekt (CPE) dyker upp i monolagret. Samla virusinnehållande supernatanten och, om nödvändigt, amplifiera virus i NIH3T3 eller BHK21-celler.
5. Infektera NIH3T3-celler medrekombinant virus genom centrifugering vid 1.800 varv per minut, 30 ° C under 30 minuter.
6. Harvest γHV68-infekterade NIH3T3-celler och förbereda cirkulariseras virala genomet med Hirt protokoll ^8,9.
7. Transform Electro-MAX DH10B kompetenta celler (Invitrogen) genom elektroporering och screena för kolonier som är resistens mot kloramfenikol (Cm), men känsliga mot kanamycin (Kan) (Cm-resistent gen i BAC ryggrad, medan Kan-resistent gen i transposon insättning).
8. Grow Cm ^{R Kan-S-kolonier} i medium innehållande chlorophenicol och förbereda BAC-DNA med mini-eller midi-skala rening (OriGene).
9. Verifiera den önskade mutationen i målgenen genom PCR, med användning av primrar som är specifika för flankerande regioner av mutationsställe och sekvensering.
10. Bekräfta ingen kromosomförändring i BAC genom spjälkning med utvalda restriktionsenzymer och puls-fält-gelelektrofores.
11. Transfektera rekombinant BAC i NIH 3T3 eller BHK21-celler med Lipofectamine2000 (Invitrogen) för att förbereda rekombinant γHV68.
12. Håll passage celler tills CPE dyker upp i monolagret. Samla virus innehåller supernatanten och förstärka rekombinant γHV68 i NIH3T3 eller BHK21 celler.
13. Bestäm titern av rekombinanta virus och karakterisera virustillväxt egenskaper ex vivo och in vivo som beskrivs i avsnitt 1 och 2.

5. Bestäm virustiter av plackanalys

1. Odla NIH3T3-celler till sub-konfluent (ca 80%) densitet före plätering celler.
2. Split NIH3T3 till 24-brunnars platta vid 20.000 celler / brunn på dag före infektion.
3. Bered 10-faldiga seriellt utspädda supernatanter virus med DMEM-medium innehållande 8% serum från nyfödd kalv (NCS).
4. Avlägsna medium och täcker NIH3T3-celler med 0,5 ml γHV68 suspension.
5. Inkubera plattan i vävnadskultur inkubator, rockar varenda 30 minuter och tillåta inkubation fortsättaunder 2 timmar.
6. Avlägsna virussuspension och celler lock med 0,5 ml DMEM-medium innehållande 2% NCS och 0,75% metylcellulosa (Sigma).
7. Inkubera plattan i vävnadskultur inkubator. Räkna plack vid dag 6 efter infektion. Färgning av monoskiktet, t.ex. med kristallviolett, kan underlätta plack räkna.
8. Beräkna den virala titern i den outspädda vävnad lysaten eller cellysat med hjälp av följande formel: Titer (PFU / ml) = D x N x 1000 ul / ml ÷ V il. N, medelvärdet av plack nummer vid en lämplig spädning, D, utspädning faldigt (såsom 5, 10, 100 .....) V (xl), volym av seriellt utspädda supernatanten tillsattes per brunn.

6. Representativa resultat:

Tre representativa siffror visas här, inklusive γHV68 lytisk replikering i lungan av vildtyp och Mavs ^{- / -} mus ^10, γHV68 lytiska fenotyper replikering i mus embryonala fibroblaster (MEF), och recombinANT γHV68 bär mutationer i de fosforyleringssäten som moduleras av Mavs-beroende IKKβ. Dessa tre bekräftande experiment utgör ett system för att definiera de roller medfödda immunförsvar komponenter i γHV68 lytisk replikation in vivo och ex vivo.

Figur 1 γHV68 laster i lungorna hos Mavs ^{+ / +} och ^- Mavs. ^{/ -} Möss. A) två huvudsakliga medfödd signalvägar nedströms Mavs. De Mavs adaptormolekyl reläer signalering från cytosoliska RIG-I-liknande receptorer för att aktivera NFkB och interferon regulatoriska faktorer (IRFS) som i sin tur upp-reglera genuttrycket av proinflammatoriska cytokiner och interferoner. B) Mavs ^{+ / +} och Mavs ^{- / -} möss infekterade med 40 PFU γHV68 intranasalt och virusbelastningen i lungan vid angivna tidpunkter var avskräcka bryts av en plackanalys med NIH3T3 monoskikt. Varje symbol representerar en mus.

Figur 2. ΓHV68 lytiska replikering kinetik i mus embryonala fibroblaster (MEF). Den lytiska replikering av γHV68 om Mavs ^{+ / +} och Mavs ^{- / -} MEF bedömdes genom flera steg tillväxtkurvor (A) och kvantitativ realtids-PCR (B). För båda experimenten, var lika antal MEF och mängden av γHV68 används för viral infektion vid en multiplicitet-av-infektion (MOI) av 0,01. (A) Celler och supernatanter skördades vid angivna tidpunkter och under förutsättning att en plackanalys för att bestämma virustitrar. (B) Totalt RNA extraherades från γHV68-infekterade MEF och analyserades genom kvantitativ realtids-PCR med primers specifika för utvalda lytiska transkript (RTA, ORF57 och ORF60).

ig3.jpg "/>
Figur 3. De lytiska replikering kinetik rekombinanta γHV68 bär mutationer inom RTA transaktiveringsdomänen som avskaffar fosforylering av IKKγ. (A) Multi-stegs tillväxtkurvor för rekombinant vildtyp virus (γHV68.wt) och mutanta virus (γHV68.mut) i Mavs ^{+ / +} och Mavs ^{- / -} MEF-celler (MOI = 0,01). MEF infekterades med γHV68 vid ett MOI av 0,01. Celler och supernatanter skördades vid angivna tidpunkter och virustitrar bestämdes genom en plackanalys med användning av NIH-3T3 monoskikt. (B) γHV68 RTA mRNA-nivå i γHV68-infekterade NIH3T3-celler (MOI = 0,01). Vid 30 timmar efter infektion, var totalt RNA extraherades från γHV68-infekterade NIH 3T3-celler och analyserades genom kvantitativ realtids-PCR.

Discussion

Som svar på viral infektion, de Mavs beroende medfödda immunförsvaret signaleringsvägar aktiveras för att främja produktionen av antivirala inflammatoriska cytokiner ^10-14. Använda mus γHV68 som en modell virus för human onkogen Kaposis sarkom-associerat herpesvirus och Epstein-Barr-virus ^3,4, upptäckte vi att γHV68 inkräktar Mavs-IKKβ Pathway to främja viral lytisk replikering via transkriptionsaktivering ^5. Använda genetiskt modifierade MEF och tekniker inom molekylär virologi, gör detta protokoll effektiv identifiering av signalering komponenter i en viss väg som är kritiska för γHV68 lytisk replikering. Som sådan innebär detta protokoll in vivo infektion, ex vivo lytisk replikering och dissektion av det medfödda immunförsvaret signalväg. Att avgränsa den molekylära mekanismen, ytterligare förfaranden inklusive bakteriell artificiell kromosom för att generera rekombinanta herpesvirus och molekylärbiologi experiment är nödvändiga. Dessutom knockout musstammar och fibroblaster är nyckeln för dessa experiment. Med ett stort antal stammar knockout mus finns, kommer detta protokoll att den molekylära dissektion av värd signalvägar och viral ingripande därav. I händelse av att knockoutmöss och MEF är inte tillgängliga (t.ex. på grund av dödlighet) kan RNAi / shRNA-medierad knockdown sökas. Ytterligare begränsningar av detta protokoll är: 1) överhörning mellan signalvägar, 2) överlappande funktioner kandidat virala faktorer, 3) eventuella dödlig effekt på γHV68 replikation genom mutationer. Även detta protokoll har tillämpats direkt identifiera roller medfödda immunförsvar komponenter i γHV68 lytisk replikering i synnerhet, kan liknande strategier kan användas för att definiera de viktiga roller i en vald komponent i andra värd signalvägar under virusinfektion in vivo och ex vivo.

Det ärviktigt att notera att vår rekombination strategi i transfekterade celler kringgår de arbets-intensiva steg som krävs för att identifiera BAC rekombinant i E. coli, vilket tillåter effektiv introduktion av mutationer i genen av intresse. Specifikt ger homolog rekombination mellan BAC och PCR-produkter som innehåller konstruerade mutationer infektiösa BAC-kloner som i sin tur ger upphov till rekombinant γHV68. Men förlitar detta protokoll på den essentiella genen och mutationer som inte är tänkta att helt inaktivera viruset. Om mutationer helt inaktivera γHV68 är transfektioner inte förväntas generera rekombinant virus. Vi inser att information lärt murin γHV68 kanske inte gäller identiskt med humant KSHV och EBV. Kan dock strategier för att dissekera viral immun skatteflykt och mekanismer utnyttjande tillämpas på dessa humana patogener med odlade celler. Våra resultat härledda från mus infektion med γHV68 sålunda kommer instruera oss av designing bättre experiment för att studera människors KSHV och EBV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006