Summary
Fenotypisk variasjon for trekk kan skyldes mutasjoner i cis-regulerende element (CRE) sekvenser som kontrollerer genuttrykk mønstre. Metoder utledet for bruk i Drosophila melanogaster kan kvantitativt sammenligne nivåene av romlige og tidsmessige mønstre av genuttrykk mediert av modifisert eller naturlig forekommende CRE varianter.
Abstract
Genuttrykk mønstre er spesifisert av cis-regulatoriske element (CRE) sekvenser, som også kalles enhancers eller cis-regulatoriske moduler. En typisk CRE besitter et arrangement av bindingssteder for flere transkripsjonsfaktorer proteiner som gir en regulerende logikk spesifisere når, hvor og på hvilket nivå det regulerte genet (e) er uttrykt. Det fulle settet med Cres innenfor et dyr genome koder organismens program for en utvikling, og empirisk så vel som teoretiske studier tyder på at mutasjoner i Cres spilt en fremtredende rolle i morfologiske utviklingen 2-4. Videre menneskelige genom bred sammenslutning studier indikerer bidra at genetisk variasjon i Cres vesentlig til fenotypisk variasjon 5,6. Dermed forståelse regulatoriske logikk og hvordan mutasjoner påvirker en slik logikk er et sentralt mål av genetikk.
Reporter transgener gir en kraftfull metode for å studere in vivo funksjosjon av Cres. Her er en kjent eller mistenkt CRE sekvensen er koblet til heterologe arrangøren og koding sekvenser for en reporter genet som koder en lett observerbare protein produktet. Når en reporter transgenet settes inn i en vertsorganisme, blir CRE aktivitet synlig i form av kodede reporter protein. P-element mediert transgenesis i bananflue arten Drosophila (D.) melanogaster 7 har blitt brukt i flere tiår å introdusere reporter transgener inn i denne modellen organisme, men genomiske plassering av transgener er tilfeldig. Derfor er reporter genaktivitet sterkt påvirket av lokale kromatin og gen miljøet ved å begrense CRE sammenligninger til å være kvalitative. I de senere årene, ble phiC31 basert integrasjon system tilpasset for bruk i D. melanogaster å sette transgener inn spesifikke genome landingssteder 8-10. Denne evnen har gjort kvantitativ måling av genet, og relevant her, CRE aktivitet 11-13 feasible. Produksjonen av transgene bananfluer kan outsources, inkludert phiC31-basert integrasjon, eliminerer behovet for å kjøpe dyrt utstyr og / eller har kompetanse på spesialiserte transgenet injeksjon protokoller.
Her presenterer vi en generell protokoll for å kvantitativt vurdere en CRE aktivitet, og vise hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å måle effekten av en introdusert mutasjon på en CRE aktivitet og å sammenligne aktivitetene orthologous Cres. Selv om eksemplene gitt er for en CRE aktive under bananflue metamorfose, kan tilnærmingen brukes til andre utviklingsstadier, bananflue arter, eller modell organismer. Til syvende og sist, bør en mer utbredt bruk av denne tilnærmingen å studere Cres fremme en forståelse av regulerende logikk og hvordan logikk kan variere og utvikle seg.
Protocol
Oversikt:
Denne videoen viser en protokoll i stand til kvantitativt måle genet regulatoriske aktiviteter for cis-regulatoriske element (CRE) sekvenser i Drosophila (D.) melanogaster. Denne protokollen kan brukes til å sammenligne de regulatoriske aktiviteter besatt av: villtype og mutant CRE former, naturlig forekommende CRE alleler funnet innenfor en art, eller orthologous Cres mellom skilte arter.
1. Stedsspesifikke integrering av reporter transgener i Drosophila melanogaster genomet
A. Reporter transgenet konstruksjon
- Som et første skritt, noen CRE evaluert må særskilt klones inn i en reporter vektor som inneholder en (1) attB bakteriell vedlegg nettstedet sekvens brukes for stedsspesifikke transgenet integrasjon 8-11 (2) multiple kloning området oppstrøms av et (3) heterologe promoter som er etterfulgt av (4) kodende sekvens for et fluorescerendeprotein (slik som EGFP eller DsRed).
- Mens enhver vektor kan gjøres kompatible for phiC31 mediert stedsspesifikke integrasjon ved å innføre et attB sekvens i vektor ryggraden, vektoren pS3aG12-14 kan fås fra addgene plasmidet repository (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG er en tilpasset versjon av P-baserte transformasjon vector15 der den ene av de to sigøyner isolatorene ble erstattet av en SfIb isolator, den inneholder en forbedret flere kloning området, og besitter en 250 basepar sekvens inneholder en attB vedlegg nettsted. Cres av interesse settes inn i flere kloning området oppstrøms en hsp70 minimal promoter og EGFP genet som koder en forbedret versjon av Green Fluorescent protein som lokaliserer til kjernen.
B. stedsspesifikke integrering av reporter transgener
- For et sett av Cres hvis virksomhet skal sammenligned som en del av reporter transgenet vektorer, er skapt vektorer separat integrert i samme genomiske landingsstedet. Her phiC31 phage integrase protein katalyserer enveis rekombinasjon mellom bakteriell (attB) vedlegg nettstedet i transgenet vektor og en genomically ligger phage (attP) vedlegg nettstedet 9. Flere grupper 8-11 har gjort et utvalg av transgene linjer som inkluderer en attP hotellet (såkalte landingssteder) og inneholder en genomisk kilde 8 av phiC31 som uttrykker dette proteinet i kjønnsceller. Disse fly bestander lett kan skaffes fra Bloomington Drosophila bestanden senter (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- En publisert protokoll foreligger viser hvordan å lage transgene Drosophila site-spesifikt bruker phiC31 integrase 16. Utstyr og teknisk ekspertise for å gjøre transgene Drosophila lines er ikke lenger nødvendig som flere leverandører eksisterer (tabell 1) til hvem denne tjenesten kan outsources.
- Transgenet atferd kan variere mye fra en vev til de neste 11. Dermed oppstår et enkelt attP landing nettstedet er ikke optimal for analyse av alle Cres, utviklingsstadier, og / eller vev av studien. Det anbefales å vurdere aktiviteten til en CRE av interesse i flere forskjellige landingssteder for å finne et sted der CRE virksomhet er representativ for den endogene target genet (s) uttrykk mønster.
- For innhentet transgene linjer er det tilrådelig å gjøre dem homozygote for transgenet. CRE aktivitet er generelt mer robust hos personer med to kopier av transgene og for kvantitative målinger er det viktig at sammenligninger mellom individer med samme antall transgenet kopier. Homozygote individer kan oppnås gjennom bruk av balanseaksel kromosomer. For godt karakterisert landingssteder skjønt, er det ofte erimpler å samle virgin hanner og hunner, og krysser de med mer intense øyenfarge fenotype gitt av mini-hvite genet (Fig. 1), den hvite mutant redning levert av integrerte transgenet vektoren er mer dramatisk i individer med to vektor kopier.
2. Innhenting av prøver eller vev av riktig utviklingsstadiet
Få prøver for analyse på det tidspunktet i utviklingen når genuttrykk mønster (s) av interesse forekommer (s) endogent, derav den tiden da CRE under etterforskning bør aktivere reporter genuttrykk. For Drosophila, kan dette være enten embryonale, larve, pupal eller voksne stadier. Nedenfor vil vi beskrive en metode for å iscenesette voksen og metamorfe fluer, sistnevnte som foregår inne i puparium, en hard larvehuden som inneholder den immobile prøven til den ecloses som voksen.
- Expand transgene linjer for å sikre specimENS av riktig scenen er tilgjengelig når du er klar til å analysere reporter genuttrykk av konfokalmikroskopi. Sett opp to ampuller hver med flere (~ 5 - 10) mannlige og kvinnelige fluer. På alternerende dager, bump fluene fra en av hetteglass til en ubrukt hetteglass. Gjenta dette for en uke. Ved utgangen av to uker, vil transgene bananfluer være tilgjengelig som spenner fra larve til voksen utviklingsstadier.
- Staging voksen flue: Den varighet av tid inne i en puparium er 98 timer for kvinner og 102 timer for menn når fostret ved 25 ° C. Voksne fluer kan lett samles når de kommer fra puparium (kalt eclosion). Dette endepunktet kan betraktes 0 timer etter eclosion. Voksne fluer kan bli oppdratt til ønsket endepunktet for analyse. For eksempel kalles en CRE mel-oe1 som styrer uttrykket av desatF genet i den voksne oenocytes av D. melanogaster kvinner ikke er aktiv umiddelbart etter eclosion men CRE aktivitet switches på etter en dag 14. Når riktig stadiet er oppnådd, anesthetize fluer og plassere i en dråpe Halocarbon olje på et lysbilde og fortsett å confocal evaluering.
- Staging prøver under metamorfose: På slutten av tredje-Instar larvestadiet de puparium er dannet. Selv på dette stadiet dyret teknisk er en tredje Instar larve er dette utviklingsstadiet lett identifiserbare som prøven er ikke-mobile, er puparium myke og hvite, og spiracles har øyelokkene snur seg utover (Fig. 2A). Dette endepunktet kan betraktes 0 timer Etter Puparium Formation (hAPF). På dette stadiet, kan menn skilles fra hunnene ved tilstedeværelse av bilateralt ligger gonadene nær midtpunktet av kroppen som vises som gjennomskinnelige sirkler (boxed i fig. 2A og indikert med svart pil i 2A ").
1. Staging basert på lengde av metamorfose:
Ved 0 hAPF, kan prøvene bli overført til en ny flaskeeller petriskål med en fuktet pensel. For å holde prøver tørker ut, legge et stykke Kimwipe og fuktes med vann. Transfer hetteglass eller rett til 25 ° C inkubator til ønsket hAPF.
2. Staging av synlige morfologiske egenskaper:
Det er ofte upraktisk å analysere prøver for CRE aktivitet på en bestemt endepunktet etter samlingen av 0 hAPF prøver. Alternativt kan man identifisere riktig iscenesatte prøvene på et tidspunkt gunstig for analyse basert på tilstedeværelse og posisjon av flere morfologiske markører (nedenfor) som er synlig gjennom puparium eller etter puparium fjerning (Fig. 2).
2a. Morfologiske kriterier for tilnærmet metamorf scenen:
- 0 hAPF: Hvit prepupa stadiet der larvene slutter å bevege seg; anterior spiracles øyelokkene snur seg utover (pil i figur 2A.); Lateral trachea synlig; myk hvit puparium (Fig. 2A).
- ~ 14 hAPF:Puparium brun og herdet; hodet sac øyelokkene snur seg utover, lateral luftrøret og gonadene mindre distinkte, bein og vinger fullt utvidet langs magen; Malpighian tubuli ennå ikke fremtredende og grønt (stiplet boks regionen i Fig. 2B.); Øynene upigmentert (Fig. 2B ') .
- ~ 25 hAPF: To parallelle Malpighian tubuli fremtredende og grønn i fargen (stiplet boks regionen i Fig. 2C.).
- ~ 40 hAPF: Mørk grønn gul kropp plassert mellom de fremre endene av Malpighian tubuli (rød pilspiss i Fig 2D.).
- ~ 50 hAPF: Gul kropp plassert på midtpunktet av Malpighian tubuli (. Boxed regionen i Fig 2E og utvidet i 2E'') og øynene er gule i fargen hvis villtype for hvite genet (trengs for rødt øye farge) . Øyenfarge mangler på dette stadiet da den hvite muterte fenotypen er reddet av mini-hvite genet som er del av det integrerte reporteren transgenet vektor (Fig. 2E ').
- ~ 80 hAPF: Wing tips grå; Malpighian tubuli ligger mellom anterior til midtpunktet av abdomen (. Boxed regionen i Fig 2G og utvidet i 2G "); folder mellom abdominal segmenter og bust på abdominal tergites er synlig (Fig. 2G og 2G "), og reddet øyenfarge er lys rød (Fig. 2G).
- ~ 90 hAPF: Wings mørkt til svart; Malpighian tubuli og gul kropp skjult av garving av tergites, thorax (pil) og abdominal bust er modne og mørke (Fig. 2H) og grønt mekonium vises på dorsal posterior tuppen av magen ( fig. 2H'').
Merknader:
- At late stadier av metamorfose, kan sex av prøvene bestemmes av genital morfologi (pilspisser i fig. 2I og 2j) eller tilstedeværelse av mørke sex kammer på det første settet av mannlige ben.
- Ytterligere presisjon i iscenesettelse kan oppnås ved vurdering av ytterligere morfologiske markører som beskrevet tidligere 17.
D. Fremgangsmåte for å fjerne prøven fra puparium:
- Ved hjelp av lab tape følger et stykke pakking tape til en disseksjon styre med den klebrige overflaten vendt oppover.
- Fukt en pensel og påfør fuktighet til pupariated prøver. Bruk en pensel, overføre prøver til en Kimwipe.
- Ved hjelp av pinsett eller en pensel, overføre prøver til pakking tape og følge med dorsal overflaten vendt oppover (buede siden av puparium).
- La prøver å tørke for ~ 15 minutter. Tørr puparium er mye lettere å åpne opp enn de som er fuktig. På dette tidspunktet prøver kan grovt iscenesatt av morfologiskemarkører synlig gjennom puparium.
- Bruk pinsett, gradvis åpne opp puparium begynnelsen på fremre operculum og fortsett mot bakre enden. Hvis et mer fin-skala disseksjon er nødvendig å isolere en bestemt vev dette kan gjøres i en klokke glass med PBS løsning. Ellers overføre puppe til en dråpe viskøs HC700 Halocarbon olje (Sigma-Aldrich) på et objektglass.
- Situate prøver på et lysbilde, med en stereomikroskop, og bruk av den overnevnte kriterier (§ 2a) en prøve etappe kan bestemmes ..
3. Confocal mikroskopisk vurdering av reporter genuttrykk i en hel montere prøve
- For hele montere prøver, kan du bruke enten 4x eller 10X mål. Med fluorescens stimulert av kvikksølv lampe eksponering, eller alternativt ved å vise i lyse feltet, juster mikroskop scenen å posisjonere prøven i det optiske området så ta prøven i fokus.
- Bruke confocal microscope programvare, justere eksitasjon bølgelengde for EGFP (eller en passende bølgelengde når du bruker en annen fluorescerende protein).
- For å hindre fotobleking en prøve, begynner med en laser intensitet på 5-10%. Hvis signalet er underwhelming, deretter øker intensiteten etter behov.
- For å forbedre signal til støyforhold for confocal bilder, aktiverer programvare innstillinger som gjennomsnittlig pixel målinger fra replikere skanner, som Kalman gjennomsnitt eller linje og stable gjennomsnitt. I vår erfaring Kalman gjennomsnitt for tre skanner forbedrer signal til støyforhold uten å gjøre det tid for bilde samlingen for lenge.
- For kvantitative sammenligninger av CRE aktivitet er det viktig at fluorescens intensiteten for en prøve ikke har mettet mange piksler. Ved hjelp av en z-del hvor fluorescens synes mest intense, justere innstillinger slik at noen piksler er mettet. Dette kan gjøres ved å bytte til en metning varsling oppslagstabellen og justere kanalen spenning, gain, og offsettil innstillinger der få piksler er mettet. Til slutt, for å samle inn tilstrekkelig signal fra en prøve er det ofte nødvendig å justere confocal blenderåpning.
- Når de optimale innstillingene er bestemt, kjøre z-scan.
- Når skanningen er fullført konvertere bildestakk inn en projeksjon og lagre dette bildet i Tagged Image File Format eller "TIFF".
Merk:
- Det er viktig å bruke de samme confocal for alle replikere prøver og reporter transgene linjer som vil inngå i en kvantitativ sammenligning av CRE aktiviteter.
Fire. Kvantifisering cis-regulerende element aktivitet
Mens noen confocal oppkjøpet programvare gir for videre behandling av projeksjon bilder, foretrekker vi å bruke den fritt tilgjengelige Bilde J program for å evaluere confocal bilder 18 år. Ved hjelp av Image J 18 registrerte GFP uttrykk mønstrekan kvantifiseres som pikselverdien statistikk innen en nærmere angitt område. Selv om bildene ikke trenger å være i gråtoner vi foretrekker å gjøre det.
- Med bilde J programmet startet, åpne en TIFF-bilde som skal evalueres.
- Klikk på frihånd knappen for valg og skissere området prøven hvor kvantifisering er ønskelig, for eksempel regionen i figur 3 innenfor den stiplede gul ramme. (Se note ett under om valg av et område til quantitate.)
- For å få en pikselverdien statistikk, klikk på kategorien Analyser og velg deretter måle. En resultater boks vises som viser området, og gjennomsnittlig, minimum og maksimum pikselverdien score. Record middelverdien pikselverdien score og gjenta for å generere pikselverdien statistikk for replikere prøver (se note b vedrørende replikere nummer).
- Vi anbefaler å samle et sekund bety piksel verdi fra en kontroll region der CRE ikke er aktivt, for eksempel regionen i figur 3 innenfor den stiplede røde grensen. Denne siste value kan trekkes fra den tidligere verdien å fjerne bakgrunn effekter fra målingen for å få en justert bety pikselverdien. Vår erfaring er dette ytterligere reduserer variasjon mellom replikere prøver (se note c vedrørende størrelsen utvalg for kontroll region).
- Bruk den justerte bety piksel verdier fra replikere prøver å beregne den gjennomsnittlige regulatoriske aktivitet for en CRE og standard feil av gjennomsnittet. Denne regulatoriske aktiviteten verdi og måling av feil kan sammenlignes med andre reporter transgener der CRE-sekvensen varierer (for eksempel figur 3).
Merknader:
- Bilde J tillater brukeren å velge en definert form og området som en gjennomsnittlig pikselverdien poengsum vil bli bestemt. Men som prøven størrelse ofte varierer vi foretrekker å bruke Freehand markeringsverktøyet til å spesifisere området som skal vurderes for hver prøve.
- Et større antall replikater (N) resulterer i en bedre estimering av gjennomsnittlig forordninglatory aktivitet for en gitt CRE. Vi finner at en N mellom 4 og 8 er vanligvis tilstrekkelig.
- Etter vår erfaring at størrelsen på kontrollen område valgt har innvirkning litt på den målte gjennomsnittlig pikselverdien for kontrollområdet. Generelt, velger vi et område proporsjonal i størrelse til området av interesse.
5. Representant Resultater:
En villtype versjon av en D. melanogaster CRE, kalt dimorf Element 13, driver et høyt nivå av EGFP reporter uttrykk i A6 abdominal segmentet av kvinnelige puppe (Fig. 3A). En 13 basepar sekvens innenfor dette elementet ble funnet å være en bindende nettsted for DSX transkripsjonsfaktor, og in vivo viktigheten av denne sekvensen kan demonstreres ved å tallfeste det regulatoriske aktiviteten for denne CRE når denne bindingen nettstedet er mutert. Tatt i betraktning den regulatoriske aktiviteten til villtype dimorf Element til å være 100 ± 5%, mutasjon av denne DSX nettstedet reduserte regulatory aktivitet til 28 ± 3%. Tilsvarende sammenligninger kan gjøres av regulatoriske aktiviteter for intraspesifikk CRE alleler eller mellom orthologous Cres fra separate arter. For eksempel vurderer nivåene av EGFP i kvinnelige segmentet A6 drevet av D. melanogaster Canton S belastning som regulatorisk aktivitet på 100 ± 4%, orthologous Cres for arten D. simulans og D. willistoni ble funnet til henholdsvis eie regulatoriske aktiviteter lik 75 ± 4% og 0 ± 0% (Fig. 3B).
Figur 1. Bruk intensiteten av hvite-redning øye fenotype å lage transgene linjer homozygot. For å kunne kvantitativt vurdere reporter transgener er det viktig at hver prøve har samme reporteren transgenet genotype. (A) En hvit genet muterte genetisk bakgrunn med en attP landingsstedet sekvensen benyttes for område-s pecific transgenet integrasjon. Transgene individer (B) hemizygous og (C) homozygot for integrert vektor kan typisk være preget av intensiteten av reddet øyenfarge fenotype med antall kopier av integrert mini hvite genet. Homozygote linjer kan etableres ved å krysse (C) mannlige og kvinnelige fluer med de mørkeste øyenfarge fenotype.
Figur 2.. Bruk av morfologiske markører for å bestemme metamorfe scenen for Drosophila. Under metamorfose fra larve til en voksen bananflue, prøven overganger gjennom en serie av stereotype morfologi som kan brukes til å bestemme kjønn og omtrentlig utbyggingsfase. Prøvene i BH har blitt fjernet fra puparium deres. Bokser i paneler A, E, F, G og H indikerer zoomet i regionene henholdsvis for paneler A ", E", F "G", og H ".
"Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
Figur 3. Kvantitativ sammenligning av cis-regulatoriske element aktiviteter. For alle prøvene EGFP-reporter genuttrykk mediert av en bestemt dimorf Element ble vurdert hos kvinner på 80 timer etter puparium formasjon. Tallet på toppen av hvert bilde er EGFP-uttrykket nivået for prøven som er beregnet som gjennomsnittet pikselverdien for A6 abdominal segmentet (indikert for øvre venstre mest bilde som regionen innenfor den stiplede gul kant) minus gjennomsnittlig pikselverdien for A4 segmentet (bakgrunn korreksjon, indisert til øvre venstre mest bilde som regionen innenfor den stiplede rød ramme). For hver reporter transgenet fire gjentak ble vurdert å beregne et gjennomsnitt segment A6 pixel verdi. Regulatoriske aktivitet rapporteres som% av (A) villtype eller (B) Canton S belastning kvinnelige bety pikselverdien ± SEM. (A) GFP uttrykk for kvinner besitter en villtype allel avDimorf Element og en mutert versjon hvor en enkelt binding nettsted for DSX transkripsjonsfaktor var ablated. Dette mutant binding nettstedet redusert dimorf Element aktivitet til 28 ± 3% av villtype sekvens. (B) Sammenligning av regulatoriske aktiviteter for sekvenser orthologous til D. melanogaster (Canton S belastning) dimorf Element. Vurderer GFP uttrykket mediert av en D. melanogaster dimorf Element allel som 100%, den orthologous sekvenser fra beslektede arter D. simulans og D. willistoni henholdsvis har aktiviteter på 75 ± 4% og 0 ± 0%.
Seks. Materialer
| Material Name | Type | Firma | Katalog nummer | Kommentar |
| Stedsspesifikke transgenet integrasjon | Tjenesten | Best Gene | Plan H | Velg et landingssted, motta transformant linjer |
| Halocarbon Oil | Reagens | Sigma-Aldrich | H8898 | Brukes til å montere prøver for confocal avbildning |
| Dumont # 5 Forceps | Tool | Fin Science Verktøy | 11252-40 | Fin spisse og holdbar for disseksjon |
| SZ61 Zoom Stereo mikroskop | Tool | Olympus | Tilpassbare | Utmerket optikk for å arbeide med fruktfluer |
| FluoView confocal mikroskop | Tool | Olympus | Tilpassbare | Gir høy oppløsning confocal bilder |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cis-regulatoriske elementer kode genomisk program som angir genuttrykk mønstre og dermed prosessen med utviklingen 1, og er fremstående steder for både mutasjoner underliggende morfologiske utviklingen 2-4 og fenotypisk variasjon for menneskelige trekk 5,6,19. På tross av denne betydning, forblir det regulatoriske logikk for Cres dårlig forstått. En fremtredende årsak til denne forståelsen underskuddet har vært mangel på egnede metoder for å kvantitativt sammenlikne funksjonelle sekvenser av Cres. Her presenterer vi en protokoll som kapitaliserer på forbedrede transgenesis metoder for D. melanogaster å legge til en kvantitativ aspekt til studiet av Cres.
I vår erfaring når kvantifisere en CRE regulatoriske aktivitet, er variasjon mellom gjenskape eksemplarer på 10% eller mindre av den justerte mener pixel verdi når gjentak er (1) av samme utviklingsstadiet og (2) reporteren transgenet eri samme genom landingsstedet. Dette beløpet av variasjon er konsistent med at fastsatt for Cres presentert i figur 3, og legger en begrensning på bruken av denne kvantitative metoden til situasjoner der genetisk forskjellige versjoner av en CRE forskjellig i regulatoriske aktivitet med en verdi større enn 10%. Viktigere skjønt, er denne begrensningen en betydelig forbedring fra de kvalitative beskrivelser av "redusert" eller "økt" som de som studerer Cres tidligere måtte bruke når de beskriver varierende aktivitet.
Når versjoner av en CRE er kjent eller funnet kvantitativt forskjellig i deres regulatoriske aktiviteter, gjør denne protokoll mulig å bestemme hvilke av mutasjonsstatus forskjellene er ansvarlig for eller bidra til aktiviteten forskjell 12,13. Evnen til å identifisere disse funksjonelt-relevant mutasjoner er et nødvendig første skritt for å bestemme de molekylære mekanismer, slik som gevinst eller tap av transcription faktor bindingssteder, forårsaker CRE aktiviteter for å avvike. Ser fram, bør bruken av denne protokollen for andre Drosophila Cres og anvendelsen av liknende metoder i protokoller for andre modellen organismer åpner for en bedre forståelse av CRE logikk å dukke opp. Dette inkluderer en evne til å diskriminere funksjonelt-relevant CRE mutasjoner fra den hengemyra av funksjonelt-nøytrale mutasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker: Nicolas Gompel og Benjamin Prud'homme for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen, Melissa Williams og fire anonyme anmeldere for kommentarer til manuskriptet, University of Dayton Graduate School for stipendiatstillinger til krig, og University of Dayton Biology avdeling og Research Institute (UDRI) for forskningsstøtte til TMW. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 11BGIA7280000 til TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
