Summary
Fenotypiska variation för egenskaper kan bero på mutationer i cis-reglerande element (CRE) sekvenser som styr genuttryck mönster. Metoder härrör för användning i Drosophila melanogaster kan kvantitativt jämföra nivåer av rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck medieras av ändrat eller naturligt förekommande CRE varianter.
Abstract
Gene expression patterns specificeras av cis-reglerande element (CRE) sekvenser, som också kallas smakförstärkare eller cis-reglerande moduler. En typisk CRE besitter ett arrangemang av bindningsställen för flera proteiner transkriptionsfaktor som ger ett regelverk logik som anger när, var och på vilken nivå de reglerade gen (er) uttrycks. Den fullständiga uppsättningen CRES inom ett djur arvsmassa kodar organismens program för utveckling 1, och empiriska samt teoretiska studier tyder på att mutationer i Cres spelade en framträdande roll i morfologisk evolution 2-4. Dessutom mänskliga genomet hela föreningen studier tyder på att genetisk variation i Cres bidra avsevärt till fenotypisk variation 5,6. Således, förståelse regelverk logik och hur mutationer påverkar en sådan logik är ett centralt mål för genetik.
Reporter transgener ger en kraftfull metod för att studera in vivo-funktionenning av Cres. Här en känd eller misstänkt CRE sekvens är kopplad till heterologa promotorn och kodning sekvenser för en reporter som kodar för ett lätt observerbara protein produkt. När en reporter transgen sätts in i en värdorganism blir CRE verksamhet synlig i form av kodade reporter protein. P-element medierad genmodifiering i bananfluga arten Drosophila (D.) melanogaster 7 har använts i årtionden att införa reporter transgener i denna modell organism, även om genomiska placering av transgener är slumpmässig. Därför är reporter genaktivitet starkt influerad av den lokala kromatin och gen miljön, och begränsar CRE jämförelser att vara kvalitativa. På senare år var phiC31 baserad integration system anpassat för användning i D. melanogaster att infoga transgener till specifika platser genomet landning 8-10. Denna förmåga har gjort kvantitativa mätningar av genen och relevant här, CRE aktivitet 11-13 feasible. Produktionen av transgena fruktflugor kan läggas ut på entreprenad, inklusive phiC31-baserad integration, vilket eliminerar behovet av att köpa dyr utrustning och / eller har kunskaper på specialiserade transgenen injektion protokoll.
Här presenterar vi ett generellt protokoll för att kvantitativt utvärdera en CRE verksamhet, och visa hur denna metod kan användas för att mäta effekterna av en introducerad mutation på en CRE verksamhet och att jämföra verksamhet orthologous Cres. Även om de exempel som ges är för en CRE aktiva under bananfluga metamorfos, kan det tillvägagångssätt kunna tillämpas på andra utvecklingsstadier, frukt arter flyga eller organismer modell. Slutligen bör en mer utbredd användning av denna metod för att studera Cres främja en förståelse för reglerande logik och hur logiken kan variera och utvecklas.
Protocol
Översikt:
Denna video visar ett protokoll som kan kvantitativt mäta genen reglerande aktiviteter för cis-reglerande element (CRE) sekvenser i Drosophila (D.) melanogaster. Detta protokoll kan användas för att jämföra med regelverket besatt av: vildtyp och mutant CRE former, naturligt CRE alleler finns inom en art, eller orthologous Cres mellan avvikit arter.
1. Platsspecifika integration av reporter transgener i Drosophila melanogaster genomet
A. Reporter transgen konstruktion
- Som ett första steg, någon CRE utvärderas måste separat klonas till en reporter vektor som innehåller en (1) attB bakteriell sekvens fastsättning webbplats används för platsspecifika transgenen integration 8-11, (2) flera kloning plats före en (3) heterologa projektansvariga som följs av (4) kodning sekvens för ett fluorescerandeprotein (t.ex. EGFP eller DsRed).
- Medan vektor kan göras kompatibelt för phiC31 medierad platsspecifik integrationen genom att införa en attB sekvens i vektorns backbone, vektorn pS3aG12-14 kan erhållas från addgene plasmiden arkiv (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG är en anpassad version av P-baserade omvandling vector15 där en av de två zigenare isolatorer ersattes av en SfIb isolator, den innehåller en förbättrad flera kloning plats, och har ett 250-sekvens baspar innehåller en attB applikationsstället. Cres av intresse är in i flera kloning platsen uppströms en hsp70 minimal promotor och EGFP gen som kodar en förbättrad version av grönt fluorescerande proteinet som lokaliserar till kärnan.
B. Platsspecifika integration av reporter transgener
- För en uppsättning av Cres vars verksamhet är att jämförad som en del av vektorer reporter transgenen, är de skapade vektorerna separat integrerade i samma genomiska landningsplatsen. Här phiC31 phage integras protein katalyserar enkelriktat rekombination mellan bakteriella (attB) fastsättning plats i transgenen vektor och en genomiskt ligger fag (attP) applikationsstället 9. Flera grupper 8-11 har gjort en mängd olika transgena linjer som inkluderar en attP plats (sk landningsplatser) och innehåller en genomisk källa 8 av phiC31 som uttrycker detta protein i könsceller. Dessa flyger lager lätt kan erhållas från Bloomington Drosophila beståndet centrum (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- En publicerad protokoll finns detaljer hur du skapar transgena Drosophila plats-specifikt med phiC31 integrashämmare 16. Den utrustning och teknisk expertis för att göra transgena Drosophila liNES inte längre behövs som flera leverantörer finns (tabell 1) för vilken denna tjänst kan läggas ut på entreprenad.
- Transgene beteende kan variera mycket från en vävnad till nästa 11. Alltså en enda attP landningsplats inte är optimal för analys av alla Cres, utvecklingsstadier och / eller vävnader av studien. Det är lämpligt att utvärdera verksamheten i en CRE av intresse i flera olika landningsplatser i syfte att hitta en plats där CRE verksamhet är representativa för den endogena målgenen (s) uttryck mönster.
- För erhållit transgena linjerna är det tillrådligt att göra dem homozygota för transgenen. CRE aktiviteten är generellt mer robust hos individer med två kopior av transgenen och kvantitativa mätningar är det viktigt att jämförelser görs mellan individer med samma antal transgen kopior. Homozygota individer kan erhållas genom användning av Balancer kromosomer. För väl karakteriserade landningsplatser är det dock ofta ärimpler att samla jungfru män och kvinnor, och korsa dem med mer intensiv ögonfärg fenotyp som följer av mini-vita gen (Fig. 1), den vita muterade räddning från den integrerade transgenen vektorn är mer dramatisk hos individer med två vektor kopior.
2. Att få exemplar eller vävnader av lämpliga utvecklingsstadiet
Skaffa prover för analys vid den tidpunkt i utvecklingen när genuttryck mönster (er) av intresse sker (s) endogent, därav den tidpunkt då CRE under utredning bör aktivera uttryck reporter genen. För Drosophila kan detta vara antingen embryonala, larver, PUPP-eller vuxna stadier. Nedan beskriver vi en metod att steg vuxen och metamorfa flugor, den senare som äger rum inom puparium, en hård larver hud som innehåller orörliga provet tills det ecloses som vuxen.
- Expandera transgena linjer för att säkerställa specimENS av riktig scen är tillgängliga när redo att analysera uttryck reporter gen av konfokalmikroskopi. Ställ in två injektionsflaskor med flera (~ 5 - 10) manliga och kvinnliga flugor. På alternerande dagar bula flugorna från en av flaskorna till en ledig flaskan. Upprepa detta för en vecka. I slutet av två veckor kommer transgena bananflugor finnas tillgängliga som sträcker sig från larv till vuxen utvecklingsstadier.
- Staging vuxna flugor: Längden på tid inne i en puparium är 98 timmar för kvinnor och 102 timmar för män när de föds upp vid 25 ° C. Vuxna flugor kan enkelt samlas in när de dyker upp från puparium (kallas eclosion). Detta tidpunkterna kan betraktas 0 timmar efter eclosion. Vuxna flugor kan födas upp tills det önskade tidpunkterna för analys. Till exempel, en så kallad CRE Mel-oe1 som styr uttryck av desatF genen i den vuxna oenocytes av D. melanogaster kvinnor är inte aktiv direkt efter eclosion men CRE aktivitet switches på efter en dag 14. När rätt scenen erhålls, söva flugor och placera i en droppe Halocarbon olja på en bild och gå vidare till konfokala utvärdering.
- Staging exemplar under förvandling: I slutet av tredje INSTAR larvstadiet den puparium bildas. Även i detta skede djuret tekniskt är fortfarande tredjedel INSTAR larv är detta utvecklingsstadium lätt identifierbara som provet är icke-mobil, är puparium mjuk och vit och spiracles har everteras (Fig. 2A). Detta tidpunkterna kan betraktas 0 timmar efter Puparium Formation (hAPF). I detta skede kan hanarna skiljas från hondjur av närvaron av bilateralt ligger könskörtlar nära mittpunkten av kroppen som visas som genomskinliga cirklar (förpackade i FIG. Och 2A visas med svarta pilen i 2A ").
1. Staging baserat på längd metamorfos:
Vid 0 hAPF kan prover överföras till en ny flaskaeller en petriskål med en fuktad pensel. För att hålla prover från uttorkning, lägga en bit Kimwipe och fukta med vatten. Överför flaska eller fat till 25 ° C inkubator tills önskad hAPF.
2. Iscensättning av synligt morfologiska funktioner:
Det är ofta besvärligt att analysera prover för CRE aktivitet vid en viss tidpunkterna efter insamling av 0 hAPF exemplar. Alternativt kan man identifiera rätt iscensatt exemplar vid en tidpunkt som passar för analys baserad på närvaro och position av flera morfologiska markörer (se nedan) som är synliga genom puparium eller efter puparium borttagning (Fig. 2).
2a. Morfologiska kriterier för att närma metamorf scen:
- 0 hAPF: Vit prepupa stadium där larven slutar röra sig, främre spiracles everteras (pilen i figur 2A.) Laterala luftstrupen synliga, mjuk vit puparium (Fig. 2A).
- ~ 14 hAPF:Puparium garvat och härdade, chef SAC everteras, lateral luftstrupen och gonader mindre tydliga, ben och vingar helt utsträckt längs buken, malpighian tubuli ännu inte framträdande och grönt (streckad boxed regionen i fig 2b.) Ögon är opigmenterade (Fig. 2B) .
- ~ 25 hAPF: Två parallella malpighian tubuli framträdande och grönt till färgen (streckad boxed regionen i Fig. 2C)..
- ~ 40 hAPF: Mörk grön gul kropp placerad mellan den främre ändar malpighian tubuli (röd pil i Fig. 2D.).
- ~ 50 hAPF: Gul kropp placerad i mitten av den malpighian tubuli (. Boxed regionen i figur 2E och utvidgades 2E'') och ögonen är gula i färg om vilda typ för vit-genen (som behövs för röda ögon färg) . Ögonfärg saknas i detta skede då den vita muterade fenotypen räddas av mini-vita gen som är en del av den integrerade reportern transgenen vektor (bild 2E).
- ~ 80 hAPF: vingspetsar grå, malpighian tubuli sitter mellan främre till mittpunkten av buken (. Boxed regionen i fig. 2G och utvidgades 2G "); veck mellan buk-segment och borst på buken tergites är synliga (bild 2G och 2G "), och räddade ögonfärg är ljus röd (bild 2G).
- ~ 90 hAPF: Wings förmörkas till svart, malpighian tubuli och gul kropp döljs av garvning av tergites, bröstkorg (pil) och buken borst är mogna och mörka (Fig. 2H), och gröna mekonium syns på rygg bakre spetsen av buken ( Fig.. 2H'').
Anmärkningar:
- På LaTe stadier av metamorfos, kan kön exemplar bestämmas genom genitala morfologi (pilspetsar i fig.. 2I och 2J) eller förekomst av mörka kön kammar på den första manliga ben.
- Ytterligare precision i iscensättningen kan uppnås genom övervägande av ytterligare morfologiska markörer som beskrivits tidigare 17.
D. Åtgärder för att ta bort prov från puparium:
- Använda lab tejp hålla sig en bit förpackningstejpen till en dissektion styrelse med den klibbiga ytan uppåt.
- Blöt en pensel och applicera fukt pupariated exemplar. Med hjälp av en pensel, överföra prover till ett Kimwipe.
- Använd pincett eller en pensel, prover överföring till förpackningstejpen och följa med den dorsala ytan uppåt (böjda sidan av puparium).
- Låt prover torka i ~ 15 minuter. Torr puparium är mycket lättare att öppna än de som är fuktig. Vid denna punkt exemplar kan grovt iscensatt av morfologiskamarkörer synliga genom puparium.
- Använd pincett, successivt öppna upp den puparium början vid den främre gällocket och vidare mot den bakre änden. Om en mer finskaliga dissektion krävs för att isolera en specifik vävnad detta kan göras på ett urglas med PBS-lösning. Annars överför puppor till en droppe trögflytande HC700 Halocarbon olja (Sigma-Aldrich) på ett objektglas.
- Placera prover på en bild med hjälp av ett stereomikroskop, och med hjälp av ovan beskrivna kriterier (avsnitt 2a) ett exemplar scen kan bestämmas ..
3. Konfokala mikroskopisk utvärdering av reportern genuttryck i en hel montera prov
- För hela montera prover, använd antingen 4x eller 10X mål. Använda fluorescens stimuleras av kvicksilver lampa exponering, eller alternativt genom att visa i ljusa fält, justera mikroskop scenen för att placera provet i det optiska området sedan ta prov i fokus.
- Använda konfokala microscope programvara, justera excitationsvåglängden för EGFP (eller en lämplig våglängd när man använder ett annat fluorescerande protein).
- För att förhindra fotoblekning ett prov, börja med en laser intensitet på 5-10%. Om signalen är underwhelming, sedan öka intensiteten efter behov.
- För att förbättra signal-brus-förhållandet för konfokala bilder, aktivera programvaran inställningar som genomsnittet pixel mätningar från replikera genomsökningar, såsom Kalman utjämning eller linje och stack genomsnitt. Enligt vår erfarenhet Kalman genomsnitt för tre skannar förbättrar signal-brus-förhållande utan att göra tiden för bildsamlingen för länge.
- För kvantitativa jämförelser av CRE aktivitet är det viktigt att fluorescensintensiteten för ett prov inte har mättat många pixlar. Med hjälp av en z-avsnitt där fluorescens visas som mest intensiv, justera inställningarna så att några få pixlar är mättade. Detta kan göras genom att byta till en saturation-varning uppslagstabell och justering av kanal spänning, förstärkning och offsettill inställningar där få pixlar är mättade. Slutligen, för att samla in tillräckligt med signal från ett prov är det ofta nödvändigt att justera konfokala bländare.
- När de optimala inställningarna bestäms, kör Z-scan.
- När genomsökningen är klar konvertera bilden stacken i en projektion och spara denna bild i Tagged Image File Format eller "TIFF".
Obs:
- Det är viktigt att använda samma konfokala inställningar för alla replikera prover och reporter linjer transgen som kommer att ingå i en kvantitativ jämförelse av CRE aktiviteter.
4. Kvantifiera cis-reglerande faktor aktivitet
Medan vissa konfokala förvärv programvara gör för vidare bearbetning av projektion bilder, föredrar vi att använda den fritt tillgängliga bildprogram J programvara för att utvärdera konfokala bilder 18. Använda bilder i J 18 inspelade GFP uttryck mönsterkan kvantifieras som pixelvärde statistik inom ett visst område. Även om bilderna inte behöver vara i gråskala vi föredrar att göra det.
- Med bilden J programmet började, öppna en TIFF-bild som ska utvärderas.
- Klicka på frihand valknappen och beskriva den del av provet där kvantifiering önskas, till exempel regionen i figur 3 inom de streckade gula gränsen. (Se anmärkning A nedan för urvalet av ett område för att kvantifiera.)
- För att få ett pixelvärde statistik, klicka på Analysera på fliken och välj åtgärd. Ett resultat ruta kommer upp som visar området, och den genomsnittliga, minsta och största pixel poäng värde. Anteckna medelvärdet pixelvärdet och upprepa för att generera pixelvärde statistik för replikera prover (se not B när det gäller replikera nummer).
- Vi rekommenderar att samla in en andra värdet betyder pixel från ett kontrollrum region där CRE inte är aktiv, till exempel regionen i figur 3 inom de streckade röda gränsen. Det senare valUE kan subtraheras från det tidigare värdet att ta bort bakgrunden effekter från mätning för att få ett justerat värde betyder pixel. Enligt vår erfarenhet Detta minskar ytterligare variation mellan kopiera prover (se not c beträffande storlek urval för kontroll regionen).
- Använd den justerade genomsnittliga pixelvärden från replikera prover för att beräkna den genomsnittliga reglerande aktivitet för en CRE och standardfel medelvärdet. Detta regleringsverksamhet värde och mätning av fel kan jämföras med andra reporter transgener där CRE sekvens skiljer sig (till exempel figur 3).
Anmärkningar:
- Bild J tillåter användaren att välja en definierad form och yta som ett medelvärde pixelvärde poäng kommer att fastställas. Men som Provstavsstorlek ofta varierar vi föredrar att använda verktyget Freehand valet att ange det område som ska utvärderas för varje prov.
- Ett större antal replikat (N) resulterar i en bättre uppskattning av den genomsnittliga förordvande aktivitet för en given CRE. Vi finner att en N mellan 4 och 8 är oftast tillräckligt.
- Enligt vår erfarenhet storleken på den markerade kontrollen området har att påverka lite på det uppmätta medelvärdet pixelvärde för kontroll regionen. I allmänhet väljer vi ett område som står i proportion i storlek till området av intresse.
5. Representativa resultat:
En vild typ version av ett D. melanogaster CRE, kallad dimorfa Element 13, driver en hög nivå av EGFP reporter uttryck i A6 buken segmentet kvinnliga puppor (Fig. 3A). En 13 baspar sekvens inom detta inslag visade sig vara ett bindningsställe för DSX transkriptionsfaktor, och in vivo vikten av denna sekvens kan visas genom att kvantifiera det föreskrivande för den här CRE när detta bindningsställe är muterad. Med tanke på den reglerande verksamheten i vildtyp dimorfa Element att vara 100 ± 5%, mutation av DSX webbplats minskade RegFÖRESKRIFTER aktivitet till 28 ± 3%. Liknande jämförelser kan göras för reglering för intraspecifika CRE alleler eller mellan orthologous Cres från olika arter. Till exempel med tanke på nivåerna av EGFP hos kvinnliga segmentet A6 drivs av D. melanogaster Canton S stammen som en reglerande aktivitet av 100 ± 4%, orthologous Cres för arten D. simulans och D. willistoni befanns respektive ha reglering lika med 75 ± 4% och 0 ± 0% (Fig. 3B).
Figur 1. Använda intensiteten i vit-räddning öga fenotyp för att göra transgena linjerna homozygot. För att kvantitativt kunna utvärdera reporter transgener Det är viktigt att varje exemplar har samma genotyp reporter transgen. (A) En vit-genen muterad genetisk bakgrund med en attP landningsplats sekvens används för plats-S ÄRSKILDA transgen integration. Transgena individer (B) hemizygous och (C) homozygota för den integrerade vektor kan normalt kännetecknas av intensiteten av den räddade ögonfärg fenotyp med antalet kopior av den integrerade mini vita genen. Homozygota linjer kan fastställas genom korsning (C) manliga och kvinnliga flyger med den mörkaste ögonfärg fenotyp.
Figur 2. Använda morfologiska markörer för att bestämma metamorfa scenen för Drosophila. Under metamorfos från larv till vuxen bananfluga, provet övergångar genom en serie stereotypa morfologier som kan användas för att bestämma kön och ungefärliga utvecklingsstadiet. Prover i BH har tagits bort från sina puparium. Lådor i paneler A, E, F, G och H anger den zoomade i regioner respektive för paneler A ", E" F ", G", och H ".
"Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
Figur 3. Kvantitativ jämförelse av cis-reglerande del aktiviteter. För alla prover EGFP-reporter genuttryck förmedlas av en viss dimorfa Element bedömdes hos honor vid 80 timmar efter puparium bildas. Numret högst upp på varje bild är EGFP-uttrycket nivå för provet som beräknas som medelvärdet pixelvärde för A6 buken segmentet (anges för det övre vänstra mest bild som regionen inom den streckade gul ram) minus den genomsnittliga pixel värde för A4-segmentet (bakgrundskorrigering, anges för det övre vänstra mest bild som regionen inom den streckade röd ram). För varje reporter transgenen fyra replikat bedömdes att beräkna ett medelvärde segment värde A6 pixel. Lagstiftningsverksamhet rapporteras som% av (A) vild typ eller (B) Canton S stam kvinnliga menar pixelvärde ± SEM. (A) GFP uttryck för kvinnlig som har en vild typ varianten avDimorfa Element och en muterad version där ett enda bindningsställe för DSX transkriptionsfaktor var borttagen. Denna mutant bindningsstället minskad dimorfa Element aktivitet till 28 ± 3% av den vilda typen sekvens. (B) Jämförelse av regelverket aktiviteter för sekvenser orthologous till D. melanogaster (Kanton S stam) dimorfa Element. Med tanke på den medierade GFP uttryck genom ett D. melanogaster dimorfa Element allelen som 100%, den orthologous sekvenser från den närbesläktade arten D. simulans och D. willistoni besitter respektive verksamhet 75 ± 4% och 0 ± 0%.
6. Material
| Materialnamn | Typ | Företag | Katalognummer | Kommentar |
| Platsspecifika transgen integration | Service | Bästa Gene | Plan H | Välj en landningsplats, få transformanten linjer |
| Halocarbon Oil | Reagens | Sigma-Aldrich | H8898 | Används för att montera prover för konfokala imaging |
| Dumont # 5 Tång | Verktyg | Fine Science Tools | 11.252-40 | Fina spetsiga och hållbara för dissektion |
| SZ61 Zoom stereomikroskop | Verktyg | Olympus | Anpassningsbara | Utmärkt optik för att arbeta med bananflugor |
| FluoView konfokalmikroskop | Verktyg | Olympus | Anpassningsbara | Ger hög upplösning konfokala bilder |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cis-reglerande element koda arvsmassans programmet som anger mönster genuttryck och därmed utvecklingsprocessen 1 och är framträdande platser för både mutationer underliggande morfologiska evolutionen 2-4 och fenotypisk variation för mänskliga drag 5,6,19. Trots detta betydelse, förblir den rättsliga logiken för Cres dåligt kända. En framträdande orsak till denna insikt underskottet har varit bristen på lämpliga metoder för att kvantitativt jämföra funktionella sekvenser av Cres. Här presenterar vi ett protokoll som kapitaliserar på bättre genmodifiering metoder för D. melanogaster att lägga en kvantitativ aspekt att studera Cres.
Enligt vår erfarenhet när kvantifiera en CRE: s regelverk verksamhet, är variation mellan kopiera exemplar av 10% eller mindre av den justerade genomsnittliga pixelvärdet när replikat är (1) i samma utvecklingsstadium och (2) reportern transgenpå samma genomiska landningsplatsen. Detta belopp av variation är förenlig med uppgifterna för det Cres presenteras i figur 3, och placerar en begränsning av tillämpningen av detta kvantitativa metoden till situationer där genetiskt distinkta versioner av en CRE skiljer sig i tillsynsverksamheten med ett värde större än 10%. Viktigt är dock denna begränsning en betydande förbättring jämfört med kvalitativa beskrivningar av "minskad" eller "ökad" att de som studerar Cres tidigare var tvungen att använda när man beskriver olika aktiviteter.
När versioner av en CRE är kända eller konstateras kvantitativt skiljer sig i sin reglering, gör detta protokoll är möjligt att bestämma vilka av mutationsstatus skillnaderna är ansvariga för eller bidra till effekten skillnaden 12,13. Förmågan att identifiera dessa funktionellt relevanta mutationer är ett nödvändigt första steg för att fastställa de molekylära mekanismer, såsom vinst eller förlust av transcriav smörjmedel faktor bindningsställen, vilket CRE aktiviteter för att skilja sig åt. Ser fram emot, bör användningen av detta protokoll för andra Drosophila Cres och tillämpningen av liknande metoder i protokollen för andra modellorganismer möjliggöra en bättre förståelse för CRE logik att växa fram. Detta inkluderar en förmåga att skilja funktionellt relevanta CRE mutationer från träsk av funktionellt neutrala mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar: Nicolas Gompel och Benjamin Prud'homme för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll, Melissa Williams och fyra anonym granskare för kommentarer på manuskriptet, University of Dayton forskarskolan för forskning stipendier till krig, och University of Dayton biologi Institutionen och Forskningsinstitut (UDRI) för forskningsstöd för TMW. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 11BGIA7280000 till TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
