قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.
Abstract
قمنا بتطوير تقنية BiFC لاختبار التفاعل بين اثنين من البروتينات في الجسم الحي. ويتم تحقيق هذا عن طريق تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة. ويمكن بعد هذه التركيبات يشترك في تحويلها إلى benthamiana نيكوتيانا عبر التحول بوساطة الأجرعية ، والسماح للتعبير العبور من البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق 1-7. لاختبار والتحقق من تفاعلات البروتين البروتين ، يمكن استخدام BiFC مع اثنين من الخميرة مقايسة (Y2H) المختلطة. وهذا قد كشف عن التفاعلات غير المباشرة التي يمكن التغاضي عنها في Y2H. بوابة التكنولوجيا منصة عالمية تتيح للباحثين المكوك الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) في كتعبير كثيرة وتحليل النظم الفنية و8،9 ممكن. لا يمكن الحفاظ على حد سواء اتجاه القراءة والإطار دون قيد أو باستخدام أنزيمات الربط لجعل التعبير عن استعداد الحيوانات المستنسخة. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن القضاء على جميع الخطوات إعادة التسلسل لضمان تحقيق نتائج متسقة في جميع أنحاء التجارب. قمنا بإنشاء سلسلة من نواقل عبارة BiFC وY2H التي توفر للباحثين متوافق مع سهلة الاستخدام الأدوات اللازمة لأداء كل من المقايسات وBiFC Y2H 10. هنا ، علينا أن نظهر للتخفيف من استخدام نظامنا BiFC لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في N. benthamiana النباتات.
Protocol
1. التحضير للثقافة الأجرعية الأجرعية سلالة GV3101 حولت سابقا مع متوافق عبارة BiFC ناقلات pEarleyGate201 – YC وpEarleyGate202 YN ، كل منها يحتوي على مزيج من الحكومة الإسرائيلية بناء. تلقيح لمدة 5 مل YEB (5G ل…
Discussion
BiFC مقايسة هو أداة قوية لدراسة التفاعلات بين البروتينات. خلافا للمقايسة Y2H التقليدية ، ليس فقط BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات ، ولكنها توفر أيضا مزيدا من المعلومات من بروتين معقد مثل شبه الخلوية التوطين. أيضا ، فمن الممكن الكشف عن التفاعلات غير مباشرة م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السادس نغوين لقراءة المخطوطات والمساعدة العامة المختبر.
Tian, G., Lu, Q., Zhang, L., Kohalmi, S. E., Cui, Y. Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System. J. Vis. Exp. (55), e3473, doi:10.3791/3473 (2011).