Vi har utvecklat en teknik för att testa protein-protein interaktioner i anläggningen. En gul fluorescerande protein (YFP) delas upp i två icke-överlappande fragment. Varje fragment är klonade i-ram till en gen av intresse via gateway, vilket gör att uttryck av fusionsproteiner. Ombildning av YFP signalen bara uppstår när förhöret proteiner interagerar.
Vi har utvecklat en BiFC teknik för att testa samspelet mellan två proteiner in vivo. Detta sker genom att dela en gul fluorescerande protein (YFP) i två icke överlappande fragment. Varje fragment är klonade i-ram till en gen av intresse. Dessa konstruktioner kan sedan samarbeta omvandlas till Nicotiana benthamiana via Agrobacterium medierad omvandling, tillåter transitering uttryck för fusionsproteiner. Blandningen av YFP signalen bara uppstår när förhöret proteiner interagerar 1-7. Att testa och validera den protein-protein interaktioner kan BiFC användas tillsammans med jäst två hybrid (Y2H) analys. Detta kan detektera indirekt interaktion som kan förbises i Y2H. Gateway-tekniken är en universell plattform som gör det möjligt för forskare att skytteltrafik genen av intresse (GOI) i lika många uttryck och funktionella system analys som möjligt 8,9. Både orienteringen och läsram kan upprätthållas utan att använda restriktionsenzymer eller ligatur för att göra uttryck redo kloner. Som ett resultat kan man eliminera alla re-sekvensering åtgärder för att säkerställa enhetliga resultat i hela experimenten. Vi har skapat en serie gateway-kompatibel BiFC och Y2H vektorer som ger forskare med enkel att använda verktyg för att utföra både BiFC och Y2H analyser 10. Här visar vi hur lätt använda vår BiFC system för att testa protein-protein interaktioner i N. benthamiana växter.
BiFC-analysen är ett kraftfullt verktyg för att studera protein interaktioner. Till skillnad från den traditionella Y2H analysen BiFC inte bara tillåter visualisering av protein-protein växelverkan, men ger också mer information om proteinkomplex som sub-cellulära lokalisering. Dessutom är det möjligt att upptäcka indirekt interaktion så länge som de två kandidaten proteiner kan föras tillräckligt nära med en tredje partner. Precis som alla teknik, har BiFC sina begränsningar. På grund av kravet på mo…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Vi Nguyen för att läsa manuskriptet och allmän lab hjälp.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Acetosyringone | Sigma | D134406 |
MES hydrate | Sigma | M2933 |
1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |