פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.
Abstract
פיתחנו טכניקה BiFC לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים in vivo. מטרה זו מושגת על ידי פיצול חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לשני שברים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן של עניין. מבנים אלה אז יכול להיות שותף להפוך ניקוטיאנה benthamiana דרך טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium, המאפשר ביטוי במעבר של חלבונים היתוך. הכינון מחדש של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה 1-7. כדי לבדוק ולאמת את חלבונים אינטראקציות, BiFC ניתן להשתמש יחד עם שני assay שמרים (Y2H) היברידית. זה יכול לזהות אינטראקציות עקיף אשר ניתן להתעלם ב Y2H. הטכנולוגיה Gateway היא פלטפורמה אוניברסאלית המאפשרת לחוקרים המעבורת הגן של עניין (GOI) לתוך כביטוי רבים מערכות אנליזה פונקציונלית כמו 8,9 אפשרי. גם הכיוון ואת מסגרת הקריאה יכול להישמר ללא שימוש אנזימי הגבלה או קשירת להפוך מוכנים ביטוי שיבוטים. כתוצאה מכך, אפשר לחסל את כל סידור מחדש של צעדים כדי להבטיח תוצאות עקביות לאורך הניסויים. יצרנו סדרה של וקטורים BiFC תואם Gateway ו Y2H אשר לספק לחוקרים עם קל להשתמש בכלים כדי לבצע מבחני הן BiFC ו Y2H 10. כאן, אנו להדגים את קלות השימוש במערכת BiFC שלנו לבדוק חלבונים אינטראקציות נ benthamiana צמחים.
Protocol
1. הכנת תרבות Agrobacterium Agrobacterium זן GV3101 שינתה בעבר עם Gateway תואם BiFC וקטור pEarleyGate201-י"ס pEarleyGate202 ו-YN, שכל אחת מהן מכילה היתוך לבנות של GOI. לחסן 5 מ"ל ייב (5 גרם ל -1 תמצית בשר בקר, 1g ל …
Discussion
Assay BiFC הוא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון. בניגוד assay Y2H המסורתית, BiFC לא רק מאפשר הדמיה של חלבונים אינטראקציות, אלא גם מספק מידע יותר מורכב החלבון כגון בלוקליזציה המשנה הסלולר. כמו כן, ניתן לזהות אינטראקציות עקיפה, כל עוד שני חלבונים מועמד אפשר להביא מספיק קרוב על י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים וי נגוין לקרוא את כתב היד וסיוע מעבדה כללית.
Tian, G., Lu, Q., Zhang, L., Kohalmi, S. E., Cui, Y. Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System. J. Vis. Exp. (55), e3473, doi:10.3791/3473 (2011).