Summary
우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.
Abstract
우리는 생체내 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하는 BiFC 기술을 개발했습니다. 이 두 아닌 중복 조각으로 분할 노란색 형광 단백질 (YFP를)에 의해 수행됩니다. 각 조각은 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 이러한 구성은 다음 융합 단백질의 통과 식을 수 있도록 Agrobacterium의 중재 변환을 통해 Nicotiana benthamiana에 공동 변형하실 수 있습니다. 심리 단백질은 1-7을 상호 작용을 때 YFP 신호의 reconstitution에만 발생합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하고 유효성을 검사하려면 BiFC는 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이것은 Y2H에서 간과된 수있는 간접적인 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 게이트웨이 기술에 관심 셔틀의 유전자를 (GOI)에 연구자 수있는 범용 플랫폼입니다 많은 표현 가능한 8,9와 같은 기능 분석 시스템과 같은. 오리 엔테이션 및 읽기 프레임 모두 표현 가능한 클론을 만들기 위해 제한 효소 또는 결합을 사용하지 않고 유지하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 실험을 통해 일관성있는 결과를 보장하기 위해 모든 다시 시퀀싱 단계를 제거할 수 있습니다. 우리는 BiFC와 Y2H 모두 assays 10을 수행하기 위해 사용하기 쉬운 도구를 통해 연구자를 제공 게이트웨이 호환 BiFC 및 Y2H 벡터 일련의를 만들었습니다. 여기, 우리는 N.에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 BiFC 시스템을 사용의 용이성을 보여주 benthamiana 식물.
Protocol
1. Agrobacterium 문화의 준비
- Agrobacterium 긴장 GV3101은 이전에 게이트웨이와 호환 BiFC 벡터 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN, 융합 GOI의 구조가 포함된 각 변형.
- BiFC 융합 단백질의 5 ML YEB (5g L -1 쇠고기 추출물, 1g L -1 효모 추출물, 5g L -1 펩톤, 5g L -1 자당, 2mM MgSO 4, 산도 7.2) 문화를 예방하기와 agrobacterium 변형 구성 적절한 항생제 선택합니다. 28 야간 문화를 성장 ° C 200 rpm으로 흔들어.
- 멸균 1.5 ML의 원심 관에 문화 1 ML를 제거합니다.
- 상온에서 10 분 1,000g에서 펠릿 세포가 뜨는 폐기.
- 침투 미디어 1 ML (5g L -1 D - 글루코오스, 50 MM MES (시그마), 2 MM 나 3 PO 4, 0.1 MM acetosyringone) 11을 추가하여 펠렛을 씻으십시오. pipetting하여 Resuspend 펠렛, 10 분 1,000g에서 다시 펠릿 세포.
- 세척 단계 두 번 더 반복합니다.
- 0.5 ML의 침투 미디어의 펠렛을 Resuspend.
- 600 nm의 흡광도에서를 측정하고 1.2-1.0로 OD 600 최종 조정합니다.
- 새로운 1.5 ML 튜브에 각 구조의 agrobacterium 정지의 동일한 금액을, 10 초위한 와동 나누어지는. 하나의 침투에 대한 각 구조 100 μL 정도 이상입니다.
- agrobacterium 혼합물은 이제 침투 준비가되었습니다.
2. 침투
- N. benthamiana 공장 16 - H 조명 및 8 - H 어두운 사이클로, 21 ° C에서 성장하고 있습니다. 6 주 된 식물 다섯은 침투에 대한 사용해야합니다.
- stomata 완전히 열 수 있도록 infiltratring 전에 1 H에 대한 하얀 빛 아래 성장 공간과 장소에서 식물을 제거합니다.
- 1 - ML 슬립 팁 투베르쿨린 주사기 바늘없이 resuspended agrobacterium 혼합을 그립니다.
- 잎의 아래쪽에 대해 주사기의 팁을 놓고 직접 손가락으로 잎의 상단을 지원하면서 부드럽게 플런저를 우울. 그것이 mesophyllar 공기 공간을 가득 채우고 같은 액체는 나뭇잎을 통해 확산됩니다.
- 미래를 식별 마커 펜으로 침투 지역을 라벨.
- 다른 구조로 침투하면 장갑을 변경하거나 infiltrations 사이에 70 % 에탄올과 그들을 청소하거나 있는지 확인하십시오. 가능하면, 교차 오염을 방지하기 위해 다른 샘플 간의 잎의 중륵맥 공간을 둡니다.
- 정상적인 성장 조건에서 성장 캐비닛에 식물을 놓습니다.
3. 재구성 YFP 신호의 관측
- 침투 영역 내에서 잎 조직의 소비세 5mm X 5mm 세그먼트
- 물 속에 들어가면, 유리 현미경 슬라이드에 coverslip으로 샘플을 커버하고 공촛점 또는 형광 현미경을 사용하여 상호 작용을 조사, 샘플을 탑재합니다.
- 시간 코스 이상의 여러 다른 위치를 표시하는 형광 융합 단백질을 높일 수 표현 / 매매 이상과 같은 표현식은 최대 5 일 후로 침투의 시간에서 24 시간마다 모니터링해야합니다.
4. 대표 결과 :
BiFC 분석하여 테스트 단백질 단백질 상호 작용의 예제는 그림 1에 표시됩니다. AtTHP1과 AtSAC3A는 효모 TREX - 2 복합 Arabidopsis 상동체의 구성 요소로 여겨지고 있습니다. 그들은 nuclearporin AtNUP1과 상호 작 용할 수 있으며 mRNA 수출 10 용이하게하실 수 있습니다. AtNUP1가 pEarlyGate202 - YN에 복제하는 동안 AtTHP1와 AtSAC3A는 pEarlyGate201 - YC으로 복제했다. 구조는 이후 GV3101으로 변형되었다. 침투에 대한 (AtNUP1 + AtSAC3A,, AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) 세 개의 구성 가능한 조합은 3와 쌍을했다. 재구성 YFP 신호 침투 후 LCSM 48시간 아래에 관찰되었다. 신호는 표피 세포에서 관찰하고 이러한 단백질의 서브 셀룰러 로컬 리 제이션과 일치 핵 주변이나 핵 플라즈마에 현지되었습니다. 부정적인 통제는 YFP 신호를 보여주지 않았다.
그림 1. Arabidopsis TREX - 2 mRNA 수출 복잡한 구성 요소가 서로 상호 작용할 수 있습니다. N. benthamiana 단풍, GOI의 구조와 공동 변화는 Leica TCS SP2 confocol 현미경을 사용하여 침투 후 48-72 H 몇 군데 있었다 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN (로 표시)로 융합된. 이미지 통합 공촛점 YFP 및 표피 N.의 밝은 필드 이미지로 표시됩니다 benthamiana 잎 세포
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Discussion
BiFC 분석은 단백질 상호 작용을 공부를위한 강력한 도구입니다. 전통 Y2H 분석과는 달리, BiFC뿐만 아니라 단백질 단백질 상호 작용의 시각화을 허용뿐만 아니라 하위 세포 지방화 같은 단백질 복잡한 더 많은 정보를 제공합니다. 또한, 그것은 두 후보 단백질이 세번째 파트너 가까이에 충분히 가져 수있는만큼 간접적인 상호 작용을 검출하는 것이 가능합니다. 모든 기술과 마찬가지로, BiFC는 제한 사항이 있습니다. 형광단 형성에 대한 분자 산소의 요구로 인해, BiFC은 산소의 존재에서 살아남기 수없는 의무를 anaerobes에서 사용할 수 없습니다. 이것은 에어로빅 생물 6 BiFC의 사용을 제한합니다. 형광단 단지의 형성은 되돌릴 수 있습니다. 이것은 다른 사람과 상호 작용하는 단백질을 방지하고 동적인 평형 6 단백질 단지의 협회와 disassociation를 중단 있습니다. 그러나,이 비가 역성은 약하거나 교통 상호 작용을 시각화하는 데 수 있습니다. 형광 단백질 조각들은 융합 아르에 대한 단백질의 독립적인 연결 제한 기능이 있습니다. 하나는 TRUE와 FALSE - 긍정적인 단백질 상호 작용 6 구별하는 데 필요한 수많은 컨트롤을 제공해야합니다. 또한, 형광단의 reconstitution가 7nm 이상의 거리에서 발생할 수로, 형광 complementation도 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 나타낼 수 있습니다. 하나는 정확한 상호 관계 7 테스트 같은 Y2H 또는 Co - Immunoprecipitation 등 다른 방법을 사용해야합니다.
신뢰할 수있는 데이터를 생성하기 위해서는 적절한 컨트롤이 결과의 해석을 위해 사용해야합니다. 그들이 attR1과 attR2 카세트 사이의 전형적인 게이트웨이 조각을 포함하는 등 빈 벡터 직접 컨트롤로 사용할 수 없습니다. 따라서 이러한 빈 벡터 정말 "빈"하지 않습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 일반적으로 컨트롤로 벡터에 융합 관련이없는 단백질 쌍을 사용합니다. 또 다른 잠재적인 문제, 특히 옛날이나 스트레스를 식물에서 식물 세포에서 자동 형광이다. 경험이 조사는 먼저 형광 배경에 익숙한 얻을 수있는 uninfiltrated 영역에서 예제를 보라 구.
최근 더 BiFC 기반 방법은 더욱 다양한 단백질의 측면, RNA 단백질 상호 작용 12, 및 DNA의 하이브리드화 13 BiFC 분석의 응용 프로그램을 확장하기 위해 개발되었습니다. 예를 들어, 여러 가지 빛깔의 BiFC 및 BiFC 기반은 살아있는 세포 14 3 원 단지를 식별하고 시각화하기 위해 개발되었습니다 (BiFC - 무서워) 분석을 무서워.
게이트웨이와 BiFC의 결합 손상 세포의 단백질 상호 작용을 이해하려는 연구자를위한 강력한 도구입니다. 우리 BiFC 시스템에 사용되는 구조는 서로 다른 조직에서 과도 표현 시스템에서 관찰되지 않을 수 있습니다 다양한 발달 단계에서 더 역동적인 단백질 상호 작용을 시각화하기 위해 안정적인 유전자 변형 식물을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 각각 우리 BiFC 벡터에서 HA 태그와 플래그 태그 (pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN)을 통합했습니다. 이 수정은 상호 작용의 시각화 후, 그러한 서부 blotting, 공동 Immunoprecipitation과 친화력 정화 등 다양한 다운 스트림 애플 리케이션을위한이 가능합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 원고와 일반적인 실험실 지원을 읽을 바이올렛 Nguyen 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
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