Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

Published: July 25, 2012 doi: 10.3791/3520
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

Summary

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

Abstract

הדור וזיהוי של כוחות מכניים הוא היבט של פיזיולוגיה התא נמצא בכל מקום, עם שייכות ישירה סרטן גרורות 1, 2 ו atherogenesis ריפוי פצעים 3. בכל הדוגמאות הללו, התאים להפעיל כוח הן על סביבתם ובמקביל enzymatically לשפץ תאי מטריקס (ECM). השפעת כוחות על ECM הפך בכך על שטח של עניין רב בשל החשיבות שלה סביר ביולוגי ורפואי 4-7.

טכניקות מולקולה בודדת, כגון השמנה אופטי 8, מיקרוסקופ כוח אטומי 9, פינצטה מגנטיים 10,11 לאפשר לחוקרים לבחון את תפקוד האנזימים ברמה המולקולרית על ידי הפעלת כוחות על חלבונים בודדים. של שיטות אלו, פינצטה מגנטי (MT) ידועות ובעלות נמוכה שלהם, קצב העברת נתונים גבוה. MT מפעילים כוחות בטווח של 1-100 ~ PN והוא יכול לספק פתרון זמני אלפית השנייה,תכונות כי הם מתאימים גם ללימוד מנגנון האנזים ברמת מולקולה בודדת 12. כאן אנו מדווחים assay MT parallelizable מאוד ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis של מולקולות חלבון בודדות. אנו מציגים דוגמה ספציפית של proteolysis של פפטיד קולגן trimeric ידי מטריקס metalloproteinase 1 (MMP-1), אך זה assay ניתן להתאים בקלות ללמוד מצעים אחרים פרוטאזות.

Protocol

1. תא זרימה הכנה

  1. Coverslips (# 1.5, 22x22 מ"מ מ"מ 22x40, VWR) מנקים באמצעות sonication.
    1. מוסיפים את coverslips למיכל זכוכית קטן מסוגל להחזיק coverslips ו להשתלב sonicator (ראה שלב 2).
    2. למלא את המיכל עם isopropanol ו sonicate ב sonicator אמבטיה במשך 20 דקות.
    3. מחק isopropanol ולשטוף את coverslips עם כמויות עצומות של מים deionized המיוצר על ידי מנגנון MilliQ Barnsted או מכשיר דומה. למלא את המיכל במים sonicate במשך 20 דקות.
    4. לאחר sonication, לייבש את coverslips בזרם של אוויר מסונן, נקי מאבק. השתמש רק coverslips המופיעים נקי (כלומר אין כתמים).
    5. בעדינות הלהבה coverslips למשך כמה שניות כדי לנקות מהם את האבק כל הלחות הנותר: לעבור את coverslips דרך להבה גז מיוצר עם מבער בונזן, נזהר שלא עיוות coverslip בשל עודף החום. צעד זה מסיר משטח שיוריתמזהמים.
  2. באמצעות דו צדדית נייר דבק, לצרף את שני coverslips יחד. חותכים את הסרט ~ 3 ס"מ אורך, 0.3 ס"מ רוחב. צרף את הקלטת על coverslip 22x40 מ"מ עוזב ערוץ 1.6 ס"מ באמצע. השתמש קצה פיפטה כדי ללחוץ בעדינות על coverslip כדי להבטיח את הקלטת דבק כראוי.

2. הגדרת מגנטי מלקטת וכיול

  1. פינצטה מגנטיים היו ההתקנה באמצעות קבע נדיר אדמה מגנטים כפי שתואר קודם לכן 10,12. אלומיניום L-סוגר נבנה עם חריר בקוטר 1 מ"מ רכוב על אנכי Z-מתרגם (Thorlabs) לווסת את גובה פינצטה את. שני קבע נדיר אדמה מגנטים צורפו סוגר משני צדי חריר ליצור מלכודת מגנטית (איור 1).
  2. הכנת ה-DNA: DNA של הפאג למבדה שכותרתו ב 5 שלה 'ו 3' מסתיים עם ביוטין digoxigenin (IDT DNA, סן דייגו, קליפורניה) שימש לכייל את MAGפינצטה netic.
    1. מערבבים 50 μL של nM 4 λ-DNA עם μL 2 של 40 ננומטר ביוטין oligonucleotide חום מצומדות ו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אז מגניב לאט בטמפרטורת החדר יותר משעה 1.
    2. הוסף ligase ה-DNA על פי מפרט היצרן ו ולקשור בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
    3. הוסף 2 μL של oligonucleotide 400 nm digoxigenin דגירה מצומדות ו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
    4. הוסף 1.5 μL של 10 mM ATP ולהמשיך קשירת oligonucleotide מצומדות digoxigenin ל-DNA-λ במשך 3 שעות.
    5. הסר את oligonucleotides עודף ligase DNA באמצעות 100 ספין KDA מסננים (Microcon Ultracell YM-100). בתמורה כוללת של 1,000 פי למאגר ב TE למאגר, יש לדאוג להסיר את oligos עודף. הערה: חשוב לא להשתמש במהירויות ספין> 500xG כי זה יוביל הגז של ה-DNA.
    6. לבדוק דגימה של הדנ"א באמצעות אלקטרופורזה על 0.7% agarose ג'ל על מנת להבטיח כי ה-DNA אנילא מפוגל או טעון.
    7. למדוד את הריכוז של ה-DNA. השימוש ספקטרומטר UV-VIS Nanodrop (Thermo Scientific) מומלץ כי נפח דגימה זמין עשוי להיות קטן מאוד.
  3. הכן תאים הזרימה, כמתואר בסעיף 1.
  4. על החיבור של ה-DNA התא זרימה, להוסיף אנטי digoxigenin נוגדנים (IgG כבשים, 1 מיקרוגרם למ"ל -1; רוש Bioscience, מנהיים, גרמניה) ולאפשר לו לדבוק משטח הזכוכית במשך 15 דקות.
  5. Passivate את פני השטח של התא זרימה כדי למנוע אי - דבק ספציפי של ה-DNA על ידי הוספת 2 מ"ג למ"ל -1 BSA, 0.1% Tween-20 ב 1x PBS. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
  6. חזור על שלב 2.5.
  7. הוסף 50 PM של fuctionalized λ-DNA ולאפשר לצרף coverslip במשך 15 דקות.
  8. לשטוף את ה-DNA העודף עם 1x PBS.
  9. הוסף streptavidin מצופים חרוזים חרוזים פאראמגנטי (1 מיקרומטר = 2 מיקרוגרם -1 מ"ל, 2.8 מיקרומטר חרוזים = 20 מיקרוגרם מ"ל -1
  10. לשטוף עם חרוזים עודף 1x PBS.
  11. כיול מגנטי מלקטת
    1. להעביר את מגנטים קבועים לתפקיד כי הוא רחוק מדגם השטח (> 15 מ"מ).
    2. מניחים את התא זרימה מוכן במיקרוסקופ.
    3. להעביר את מגנטים קבועים למצב מעל התא זרימה.
    4. בחר את המטוס מרחק של λ-DNA חרוזים פונקציונליות תוך התמקדות חרוזים במרחק שני משטחי זכוכית. משטח הפוקוס הנכונה היא זו שבה את החרוזים הרצויים לנו מרכז בהיר.
    5. קח וידאו של תנועה חרוז ב 80 הרץ ומעלה 500 מסגרות.
    6. הזז את המגנט קרוב יותר מדגם השטח. מעבר למרחקים 5 מ"מ, להעביר במרווחים של 1 מ"מ. למרחקים בין 1 מ"מ ו - 5, לנוע במרווחים של 0.5 מ"מ. למרחקים פחות מ 1 מ"מ, לנוע במרווחים של 0.25 מ"מ.
    7. חזור על שלבים 2.11.5 ו 2.11.6 במיקום זה מגנט חדש.
    8. עבור כל הנתוניםנקבע, לעקוב אחר מרכז את החרוזים באמצעות התאמה 2D גאוס.
    9. לחשב את הכוח באמצעות תנודות הבראונית באמצעות:

    משוואה 1
    כאשר k B T הוא אנרגיה תרמית בולצמן, L הוא אורך ה-DNA λ, ו <x 2> הוא את השונות במצב centroid.

    1. לאשר את הדיוק של הכוחות על ידי בדיקת חישוב הכוח באמצעות התאמה קשת כוח הלורנצי כדי למצוא את התדר rolloff. הכוח ליישם קשורה לתדירות rolloff ידי היחס:

    משוואה 2
    כאשר 0 ƒ הוא תדר rolloff, הוא רדיוס חרוז, ו μ הוא צמיגות הנוזל 12.

3. קולגן פפטיד קובץ מצורף לתאים זרימה

כדי לתת דוגמה קונקרטית עבור היישום של המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים העבודה האחרונה במעבדה שלנו המאפיינת proteolysis של קולגן פפטיד trimeric המודל. אנו צופים כי גישה זו בכלל ניתן ליישם באופן רחב חלבונים polynucleotides אחרים.

  1. הפפטיד מודל קולגן מורכב התג שלו-N-terminal 6x לטיהור, ואחריו תג myc 5x (תחנת הכוח של עזה) 10 לאכוף היווצרות הסליל המשולש, קולגן α1 שאריות 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), המהווים MMP- 1 האתר הכרה, רצף foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ו-C מסוף KKCK כדי להקל על סימון ביוטין, maleimide. Foldon נובע fibritin T4-הפאג חלבון, מייצב מודל trimers קולגן כאשר התמזגו ב או N - או C-הסופית 13,14.
  2. פפטיד קולגן MMP-1 באו לידי ביטוי חלבונים מטוהרים כפי שתואר קודם לכן 4,15. </ Li>
  3. הוסף אנטי-myc (15 מיקרוגרם מ"ל -1) לתא זרימה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר אנטי-myc לצרף אל פני השטח של התא זרימה.
  4. Passivate התא זרימה כדי למנוע הלא ספציפית מצורף של חלבונים באמצעות 5 מ"ג למ"ל -1 BSA באותו אופן כפי שתואר בשלב 2.5.
  5. הוספת 150 קולגן פפטיד PM ולאפשר לו לצרף נוגדנים באמצעות תג myc במשך 45 דקות.
  6. לשטוף את עודפי קולגן באמצעות PBS המאגר.
  7. הוסף חרוזים מצופים streptavidin פאראמגנטי (1 חרוזים מיקרומטר = 2 מיקרוגרם -1 מ"ל ו -2.8 מיקרומטר חרוזים = 20 מיקרוגרם מ"ל -1) ולאפשר להם לצרף את מולקולות קולגן במשך 45 דקות. 1 החרוזים מיקרומטר יש לדלל את הריכוז הרצוי PBS. 3 החרוזים מיקרומטר יש להפריד פתרון באמצעות מגנטים חזקים, resolubilized אז PBS. תהליך זה יש לחזור 3 פעמים. שמנו לב כי צעד זה הוא חיוני כדי GEלא 3 חרוזים מיקרומטר להיקשר פפטיד פני משותק קולגן.

4. Proteolysis חיל Assay

  1. לאחר התא זרימה מורכב עם פפטיד קולגן חרוזים מגנטיים, התמונה התא זרימה במלכודת המגנטי תחת כוח נמוך, PN ~ 1. מניסיוננו, subpopulation של החרוזים הוא לפעמים דבק חלש אל פני השטח באופן בלתי ספציפי. הפעלה של כוח צנוע מבטיח כי החרוזים האלה משוחררים.
  2. הוספת האנזים הפעיל אל התא זרימה. במקרה זה MMP-1 היה מראש מופעל על ידי הוספת 3.5 מ"מ APMA (4-aminophenylmercuric אצטט) ו מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. ההפעלה אומתה באמצעות SDS-PAGE.
  3. ברגע התא זרימה מחדש מוחדר מכשיר פינצטה מגנטי, להקליט וידאו פורש כמה שדות של נוף, בדרך כלל מניב כמה מאות חרוזים המצורפים. זה יהיה t = 0.
  4. חזור על אותו תהליך של רישום מספר שדות של התצוגה (תוך חזרה tהו אותו שדה הראייה) בנקודות זמן קבועות, עד כל חרוזי לנתק או לא proteolysis נוספת היא להבחין.
  5. ניתוח נתונים הקינטית
    1. לספור את החרוזים בתחומים שונים של נוף בנקודות זמן שונות וממוצע אותם. לנרמל את מספר החרוזים על ידי חלוקת המספר הממוצע של חרוזים בכל נקודת זמן על ידי מספר של חרוזים בזמן t = 0. הדבר מבטיח כי אנחנו יכולים להשוות את שיעורי proteolysis מניסויים שונים, כי המספר המוחלט של החרוזים יהיה שונה מניסוי לניסוי.
    2. להתוות את היחס כפונקציה של הזמן. במקרה זה, אנחנו מצויד אותו ריקבון מעריכי בתוספת קבועה.

    המשוואה 3
    שם ƒ (t) הוא היחס בין החרוזים המצורפת (או מולקולות קולגן unproteolyzed), לא הזמן, הוא שבריר של חרוזים שיצרף לקשור קולגן, b הוא קצב הדעיכה קבוע, ו-Cהוא חלק קטן של חרוזים המצורפים לא במיוחד.

    1. הניסוי אותו חוזר על עצמו בכל שינוי בכוח MMP-1 ריכוזים על מנת להבהיר את ההשפעה של כוח על ידי proteolysis קולגן MMP-1.

5. נציג תוצאות

הפרוטוקול הנ"ל מתאר שימוש הרומן של פינצטה מגנטיים (איור 1) לחקר השפעת כוח על proteolysis האנזימטית. אנחנו לכייל את הפינצטה של 1 מיקרומטר ו -3 חרוזים מיקרומטר בשתי גודל התנודות הבראונית הנצפות וחישוב תדירות הכלח על עמדות מגנט שונים (איור 2). בניסויים proteolysis כוח, ההתקנה דומה, פרט לכך DNA מוחלף קולגן (איורים 3, 4). מספר מנורמל של חרוזים הנותרים ניתן להתוות כפונקציה של זמן כדי למצוא את שיעורי proteolysis (איור 5), תהליך זה יכול להיותחזר על האנזים בריכוזים שונים וכוחות.

איור 1
באיור 1. סכמטי של תהליך מלכודת מגנטית כיול (לא בקנה מידה). שני מגנטים קבועים הארץ נדיר ליצור שדה מגנטי שמושך על פאראמגנטי חרוז. תרגום מגנט למעלה ולמטה מתאים את הכוח ליישם. החרוזים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ רגיל בהיר שדה עם חלוף אור דרך חריר בין שני מגנטים הבלעה. התמונה נלקחה במטרה אוויר 40X. את החדות, כתמים עגולים מתאימות את החרוזים מחוברים אל פני השטח coverslip. את מחוץ להתמקד באובייקטים חרוזים הם מנותקים.

איור 2
איור 2. מגרשים של כוח מכויל כפונקציה של מרחק המגנט מפני השטח מדגם של 1 מיקרומטר (משמאל) 2.8 מיקרומטר (מימין) חרוזs. הנתונים היו כשירים לתפקד אמפירית Equation4 , כאשר x הוא המרחק בין המגנט. = 31.8, B = 5.61, ו-C = 4.39 עבור 1 חרוזים מיקרומטר ו = 140, B = 3.10 ו-C = 1.86 במשך 3 חרוזים מיקרומטר. ערכים אלה הם ספציפיים למכשיר הספציפי שלנו וגיאומטריה ניסיוני, וכל מכשיר צריך להיות מכויל בנפרד. הסורגים שגיאה בשלב זה לייצג השתנות ~ 10% בכוח להחיל על חרוז בסיס חרוז, עקב השתנות בגודל חרוז. הכוח ליישם עומד ביחס לנפח של החרוזים, והיקף חרוז משתנה ~ 9% מעל הממוצע (על פי מפרט היצרן).

איור 3
3. איור חיל proteolysis ההתקנה assay (לא בקנה מידה). Trimer מודל קולגן מחובר אל פני השטח של coverslip דרך מ 'י"ס / אנטי-myc הצמידה. Streptavidin מצופה חרוזים פאראמגנטי מחוברים את trimers קולגן באמצעות הצמדה ביוטין-streptavidin. פעיל MMP-1 חותך את קולגן לאורך זמן, גורם החרוזים לנתק מפני השטח ולעבור מן המטוס מרחק.

איור 4
איור 4. הקריקטורה סכמטי של proteolysis כפונקציה של הזמן. הקריקטורה מראה שדה מדגם של נוף עם הזמן, ככל proteolysis מתרחשת. עם הזמן, MMP-1 חותך את הקולגן ואת חרוזים להתנתק ולהתרחק מהמטוס מוקד בהשפעת השדה המגנטי.

איור 5
איור 5. שיעורי proteolysis תלוי יישומי כוח 16. הם הראו הנתונים שנאספו על 1.0 PN (3 מיקרומטר MMP-1, שחור), 6.2 PN (3 מיקרומטר MMP-1, אדום) ו 13 pn (0.2 מיקרומטר MMP-1, קוסםנ.ת. ע). שיעורי proteolysis פרמטרים (בכושר) הם: 0.22 ± 0.02 דק '-1 (1 PN), 0.46 ± 0.09 דק' -1 (6.2 PN), ו 2.08 ± 0.18 דק '-1 (13 PN). את החלק היחסי של חרוזים unproteolyzed בנקודות זמן רב (> 15 דקות) נשארת קבועה על כ ~ 0.25 על ניסויים שונים. ברים שגיאה מתאימות הסטטיסטיקה פואסון המשקף את מספר התצפיות בכל נקודת זמן. שגיאה בכל נקודת זמן חרוזים n הוא n 1/2. שגיאה בשבריר של חרוזים המחוברים חושב על ידי שגיאה propagation.1 חרוזים מיקרומטר שימשו PN 1.0 ו 6.2 ניסויים PN ו -2.8 מיקרומטר חרוזים שימשו 13 ניסויים PN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שימוש חדש במולקולה טכניקה קלאסית אחת. פינצטה מגנטיים מאפשרים בינונית עד גבוהה התפוקה מבחני מולקולה בודדת בצורה יעילה וחסכונית. עם זאת, כמו כל ניסיוני בטכניקות ישנם אתגרים ואת החסרונות פוטנציאליים.

מגבלות פינצטה מגנטיים

לעומת מלכודת אופטי רזולוציה במרחב ובזמן של מנגנון MT הוא נמוך. יתר על כן, הכוחות שנוצר על ידי MT הפשוטה המתוארת כאן הם PN 30 או פחות, באופן משמעותי פחות כוח לגשת באופן שגרתי ניסויים AFM. מגבלה זו יכולה להיות בתוקף: MT הם גם מתאים יישום המשנה PN כוחות.

שלא כמו מלכודת אופטי או AFM, MT קונבנציונלי, כגון המנגנון כאן, לא לאפשר מניפולציה של חלקיקים בודדים. מלכודות אופטיות משמשות בדרך כלל להפעיל כוח במקביל coverslip, בעוד MT הם הכי מתאים ניסויים המושכים אנכיים. Electromagneטיק MT לפתור את המגבלות, אם כי במחיר של מורכבות גוברת.

פינצטה כיול

הן תנודות הבראונית ספקטרום ניתוח הכוח לצורך כיול יש מגבלות הכוח שלהם. מצאנו, כי שיטת תנודות הבראונית הוא רגיש במיוחד לטשטש המצלמה. כמו מסגרת הדולר עלה (זמן החשיפה ירד) כוח חישוב פחת. בפועל, הגדלנו את המסגרת הדולר עד הכוחות מחושבים מתנודות הבראונית הסכים עם כוחות מחושבים באמצעות ספקטרום הכוח בתוך 10%. לעומת זאת, ניתוח ספקטרום הכוח הוא חזק יותר מול המצלמה מטושטש, אבל קצת קשה יותר ליישם. מומלץ לבצע שני חישובים כדי לבדוק את חוסנו של התוצאות.

נציין, כי שינויים בגודל חרוז החלקיקים מגנטי תוכן לגרום לשינויים בכוח ליישם של 10% ~. אפקט זה לא היה חשוב בניסוי האחרון שלנו להיותכי אנחנו בממוצע על פני מאות חרוזים ב כל מדידה. עם זאת, ניסויים לחלץ מידע ייחודי מכל חרוז קשור שעלולים לדרוש שיטת כיול מדויק יותר.

בקרות כדי להבטיח קבצים נקודה אחת

השגת ספציפיים, אוריינטציה, נקודה אחת קבצים מצורפים לעתים קרובות האתגר המעשי במחקרים מולקולה בודדת. הפקדים הבאים אישר התקשרות מסוים של קולגן כדי נוגדנים, וחרוזים קולגן:

  1. נוסף חרוזים רק לתא זרימת פסיבציה עם BSA.
  2. נוסף אנטי-myc, חרוזים פסיבציה עם BSA ואחר כך הוסיף.
  3. נוסף אנטי-myc, פסיבציה עם ארגון ה-BSA, הוסיף שאינו biotinylated קולגן ואז הוסיף חרוזים.
  4. פסיבציה עם ארגון ה-BSA, הוסיף שאינו biotinylated קולגן חרוזים ואחר כך הוסיף.
  5. פסיבציה עם ארגון ה-BSA, הוסיף קולגן biotinylated וחרוזים הוסיף אז.
  6. נוסף אנטי-myc, פסיבציה עם ארגון ה-BSA, הוסיף ביוטיןקולגן ylated וחרוזים הוסיף אז.

במקרים 1-5, כאשר חלק מרכיב של הסדרה מצורף הושמט במכוון, מקום מ 0 עד 4 חרוזים נראו מחוברים התא זרימה לכל שדה הראיה (80,000 מיקרומטר 2). רק 6 במקרה, שבו כל moieties התקשרות קיימים, ראינו ~~~HEAD=NNS 30-60 2.8 מיקרומטר ו 80-200 חרוזים חרוזים 1 מיקרומטר מחוברים אל פני השטח. קינטיקה proteolysis נצפתה כראוי הם מתאימים על ידי מעריכי יחיד בתוספת מונח קבוע, אשר מראים כי יש רק אחד שיעור הגבלת צעד, ולכן רק גבול אחד. טווח הזמן עשוי משקף חרוזים המצורפים הלא ספציפית coverslip.

אנו מדווחים על ריכוזי נוגדנים וחלבון שעבדו לניסוי שלנו. מגוון רחב של ריכוזים עבור כל רכיב יש לבחון בעת ​​פיתוח assay חדש. BSA עבד גם סוכן השטח פסיבציה בניסוי שלנו. עם זאת, נפגשוהוד לא יכול לעבוד בכל מצב. פרוטוקולים אחרים פסיבציה פני השטח יש גם שימש בהצלחה. דוגמאות כוללות פוליאתילן גליקול פונקציונליות זכוכית שקופיות 17, bilayers השומנים הנתמכים 18 או קזאין כסוכן חוסם.

הערות על ניתוח נתונים

בניסויים proteolysis כוח, תמיד יש איזה ניתוק הלא ספציפית (בעיקר לעבר כוחות גבוהים יותר 19) בשל ניתוק של לא קוולנטיים (למשל ביוטין - streptavidin) אינטראקציות. אנו להסביר את התופעה על ידי מדידת proteolysis ב MMP-1 ריכוזים שונים, כולל לא MMP-1, כמתואר Adhikari et. אל. proteolysis מדידה בבית MMP-1 ריכוזים שונים של כל הכוחות מאפשר לנו ליצור מיכאליס מנטן, עקומות, שבו נעשה שימוש כדי לחשב את יעילות קטליטית k cat / K M של האנזים. לחלופין, אם ריכוזים שונים של האנזים לא נמצאים בשימוש, מומלץמדידה מלאה לעשות עם האנזים ללא כוחות שניתנו להחסיר את שיעור ניתוק שאינו ספציפי.

יישומים אפשריים

את פינצטה מגנטיים מכסים מגוון רחב כוח. הכוחות אפשר להפעיל תלוי בגודל של החרוזים. 1 מיקרומטר ו -2.8 מיקרומטר חרוזים חפיפה כוחות נגיש, מניסיוננו, באמצעות אחת את החרוזים על כוחות הביניים עובד היטב.

אנו צופים כי גישות ניסיוניות דומות עשויות לחול באופן רחב בלימוד proteolysis כוח תלויה 4,20, התגלגלות 21 ואינטראקציות מחייב 22. אנחנו ועוד 23 ציינו כי ברדיוס של טבעות עקיפה של חרוזים מתוך מיקוד מספק אמצעי רגיש למעקב אחר המיקום היחסי של החרוזים כדי coverslip 23. אמנם בדרך כלל לא נעשה שימוש בדרך זו, אנו מאמינים כי מבחני הר יש את היכולת לספק ננומטר דיוק MEAsurements הדינמיקה של חלבונים מבניים. מידע נוסף זה עשוי להיות בעל ערך במיוחד בהקשר של proteolysis הכוח תלוי או המדידות מחייב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז קריירה Wellcome בממשק המדעי (ARD), המכון הלאומי לבריאות בארה"ב באמצעות תוכנית חדשה של מנהל NIH פרס ממציא 1-DP2-OD007078 (ARD), המלכה האם ויליאם ג'וניור בוגר סטנפורד אחוות (ASA ), ואת לב וכלי דם במכון סטנפורד אחוות הצעיר Predoctoral (JC). המחברים מודים ג'יימס Spudich עבור הלואה ציוד במיקרוסקופ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Cover Glass #1.5 (22x22) VWR 48366-067
Micro Cover Glass #1.5 (22x40) VWR 48393-048
Lambda DNA Invitrogen 25250-010
T4 DNA Ligase Invitrogen 15224-041
Microcon Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-Digoxigenin Roche Diagnostics 11-333-089-001
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Anti-myc Antibody Invitrogen 46-0603
Bovine Serum Albumin Sigma B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin Invitrogen 658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetate Calbiochem 164610
Biotin-Maleimide Sigma Aldrich B1267
Biotin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Digoxigenin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Collagen peptide gene DNA 2.0 Custom synthesis
MMP-1 cDNA Harvard Plasmid Database
z-translator Thorlabs MTS50
Servo controller for translator Thorlabs TDC001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
  3. Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
  4. Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
  5. Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
  6. Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
  7. Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
  8. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  9. Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
  10. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  11. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
  13. Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
  14. Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
  15. Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
  16. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  17. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  18. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
  19. Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
  20. Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
  21. Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
  22. del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
  23. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).

Tags

Bioengineering גיליון 65 הנדסה כימית פיסיקה מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה פינצטה מגנטיים proteolysis כוח קולגן MMP-1
מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A.… More

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (65), e3520, doi:10.3791/3520 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter