Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter

Published: July 25, 2012 doi: 10.3791/3520
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

Summary

I denne artikel vil vi beskrive brugen af ​​magnetiske pincet for at studere effekten af ​​kraft på enzymatisk proteolyse på enkelt molekyle niveau i en meget parallelizable måde.

Abstract

Generering og detektering af mekaniske kræfter er en allestedsnærværende del af celle fysiologi, med direkte relevans til kræft metastase 1, atherogenese 2 og sårheling 3. I hvert af disse eksempler, såvel celler udøver kraft på deres omgivelser og samtidig enzymatisk remodel den ekstracellulære matrix (ECM). Effekten af kræfter på ECM er således blevet et område af stor interesse på grund af dets sandsynlige biologiske og medicinske betydning 4-7.

Enkelt molekyle teknikker, såsom optisk indfangning 8, atomic force microscopy 9, og magnetiske pincet 10,11 give forskere at undersøge funktionen af enzymer på molekylært niveau ved at udøve kræfter på individuelle proteiner. Af disse teknikker, er magnetiske pincet (MT), kendt for deres lave omkostninger og høj kapacitet. MT udøve kræfter i området på ca 1 til 100 PN og kan tilvejebringe millisekund tidsmæssige opløsning,egenskaber, der passer godt til studiet af enzymet mekanisme på enkelt-molekyle niveau 12. Her rapporterer vi en meget parallelizable MT assay for at studere virkningen af ​​kraft på proteolyse af enkelte proteinmolekyler. Vi præsenterer det specifikke eksempel af proteolyse af et trimert collagen peptid ved matrixmetalloproteinase 1 (MMP-1), men kan dette assay kan let tilpasses til at studere andre substrater og proteaser.

Protocol

1. Flowcelle Fremstilling

  1. Dækglas (# 1,5, 22x22 mm og 22x40 mm, VWR) renses ved hjælp af sonikering.
    1. Tilføje dækglas med en lille glasbeholder stand til at rumme dækglas og montering i sonikator (se trin 2).
    2. Fylde beholderen med isopropanol og sonikeres i en bad-sonikator i 20 minutter.
    3. Kassér isopropanol og skyl dækglassene med rigelige mængder deioniseret vand fremstilles ved en Barnsted MilliQ apparat eller lignende anordning. Fylde beholderen med vand og sonikeres i 20 minutter.
    4. Efter sonikering, tørre dækglas i en strøm af filtreret, støv-fri luft. Brug kun dækglas, der vises rene (dvs. ingen pletter).
    5. Forsigtigt flamme de dækglassene i nogle få sekunder at rense dem for eventuelt resterende støv og fugt: passerer dækglassene gennem en gasflamme er produceret med en bunsenbrænder, pas på ikke at warp dækglasset på grund af overskydende varme. Dette trin fjerner resterende overfladekontaminanter.
  2. Ved hjælp af dobbeltsidet tape, lægger de to dækglassene sammen. Afskære båndet ~ 3 cm i længde og 0,3 cm i bredden. Fæstne tapen på 22x40 mm dækglas efterlader en 1,6 cm kanal i midten. Brug en pipette tip til forsigtigt at trykke ned på dækglasset at sikre, at tapen korrekt har levet.

2. Magnetic pincet Opsætning og kalibrering

  1. Magnetiske pincet var indretning ved permanente sjældne jordmagneter som beskrevet tidligere 10,12. Et aluminium-L-konsol blev konstrueret med en diameter på 1 mm hul og monteret på en lodret z-oversætter (Thorlabs) til at modulere højden af ​​pincet. To faste sjældne jordmagneter blev fastgjort til holderen på hver side af det lille hul for at danne det magnetiske fælden (figur 1).
  2. DNA-præparation: DNA fra lambda-fag mærket i 5'-og 3'-ender med biotin og digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) blev anvendt til at kalibrere magtiske pincet.
    1. Bland 50 pi 4 nM λ-DNA med 2 pi 40 nM biotinkonjugeret oligonukleotid og opvarmes ved 60 ° C i 10 minutter. Derefter langsomt afkøle til stuetemperatur i løbet af 1 time.
    2. Tilsættes DNA-ligase i overensstemmelse med producentens anvisninger og liger ved stuetemperatur i 3 timer.
    3. Tilsættes 2 pi 400 nM digoxigenin konjugeret oligonukleotid, og der inkuberes ved stuetemperatur i 45 minutter.
    4. Tilsættes 1,5 pi 10 mM ATP og fortsætte ligering af digoxigenin konjugeret oligonukleotid til λ-DNA i 3 timer.
    5. Fjerne overskydende oligonukleotider og DNA-ligase ved hjælp 100 kDa centrifugering filtre (Microcon Ultracell YM-100). I alt 1000-fold bufferudskiftning i TE-buffer er tilstrækkelig til at fjerne overskydende oligoer. Bemærk: Det er vigtigt ikke at bruge spin-hastigheder> 500 x g, fordi det vil føre til klipning af DNA.
    6. Undersøge en prøve af DNA via elektroforese på en 0,7% agarosegel for at sikre, at DNA'et ier ikke denatureres eller forskydes.
    7. Måle koncentrationen af ​​DNA. Anvendelsen af ​​en Nanodrop UV-Vis spektrometer (Thermo Scientific) anbefales, fordi det tilgængelige prøvevolumenet kan være meget lille.
  3. Forbered flow-celler som beskrevet i afsnit 1.
  4. Til fastgørelse af DNA'et til flowcellen, tilsættes anti-digoxigenin antistof (får-IgG; 1 ug ml-1; Roche Bioscience, Manheim, Tyskland) og tillader den at klæbe til glasoverfladen i 15 minutter.
  5. Passivere overfladen af flowcellen for at forhindre non-specifik vedhæftning af DNA ved tilsætning af 2 mg ml-1 BSA, 0,1% Tween-20 i 1X PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 45 minutter.
  6. Gentag trin 2.5.
  7. Tilsættes 50 pM fuctionalized λ-DNA og tillade at fastgøre dækglasset i 15 minutter.
  8. Bortvaskes overskud DNA med 1x PBS.
  9. Tilsættes streptavidin-coatede superparamagnetiske kugler (1 uM perler = 2 ug ml-1; 2,8 um perlerne = 20 ug ml-1
  10. Bortvaskes overskydende perler med 1x PBS.
  11. Magnetisk pincet Kalibrering
    1. Bevæge de permanente magneter til en position, der er langt væk fra prøveoverfladen (> 15 mm).
    2. Anbring den fremstillede flowcellen i mikroskopet.
    3. Bevæge de permanente magneter i position oven over flowcellen.
    4. Vælge fokalplan af λ-DNA funktionaliserede perler ved at fokusere på perlerne væk fra begge glasoverflader. Den korrekte brændplanet er én, hvor de ønskede perler har en lys center.
    5. Tag en video af perle bevægelse ved 80 Hz eller større for 500 frames.
    6. Bevæge magneten tættere på prøveoverfladen. For afstande over 5 mm, bevæge sig i 1 mm. For afstande mellem 1 og 5 mm, bevæger sig i 0,5 mm intervaller. For afstande mindre end 1 mm, bevæge sig i 0,25 mm stigninger.
    7. Gentag trin 2.11.5 og 2.11.6 i hver ny magnet position.
    8. For hver dataindstillet, spore midten af ​​perlerne med et 2D gaussisk pasform.
    9. Beregne kraft via Brownske svingninger ved anvendelse af:

    Ligning 1
    hvor k B T er Boltzmann varmeenergi, L er længden af λ-DNA og <x 2> er variansen i centroiden position.

    1. Bekræft nøjagtigheden af ​​de kræfter, ved at kontrollere den kraft beregning via en kraftspektret Lorentz pasform i for at finde de rolloff frekvens. Påførte kraft er relateret til afskæring frekvens ved relationen:

    Ligning 2
    Hvor ƒ 0 er rolloff frekvens, a er vulsten radius, og μ er viskositeten 12.

3. Kollagenpeptid Tilknytning til flowceller

For at tilvejebringe et konkret eksempel for anvendelsen af ​​vores metode, beskriver vi nyligt arbejde i vort laboratorium, som kendetegner proteolyse af et trimert collagen modelpeptid. Vi forventer, at denne generelle tilgang kan bredt anvendes på andre proteiner og polynucleotider.

  1. Kollagen modelpeptid består af en N-terminal 6x His-tag til oprensning, efterfulgt af en 5 x myc tag (GPP) 10 til at håndhæve tredobbelt helix dannelse, kollagen a1 rester 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), som danner MMP- 1 genkendelsessted er foldon sekvens (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) og en C-terminal KKCK at lette mærkning med biotin-maleimid. Foldon stammer fra T4-fag-protein fibritin og stabiliserer collagen model trimerer når den fusioneres ved enten N - eller C-terminale 13,14.
  2. Kollagen peptid og MMP-1-proteiner blev udtrykt og oprenset som beskrevet tidligere 4,15. </ Li>
  3. Tilsættes anti-myc (15 ug ml-1) til flow-celle og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter for at tillade anti-myc at fastgøre overfladen af flowcellen.
  4. Passivere flowcellen for at forhindre non-specifik binding af proteiner ved hjælp af 5 mg ml-1 BSA på samme måde som beskrevet i trin 2.5.
  5. Tilsæt 150 pM collagen peptid og tillader den at fastgøre til antistoffet via myc tag i 45 minutter.
  6. Bortvaskes overskud collagen ved hjælp af PBS-buffer.
  7. Tilsættes streptavidin-coatede superparamagnetiske kugler (1 uM perler = 2 ug ml-1 og 2,8 um perler = 20 ug ml-1) og tillade dem at fastgøre de collagenmolekyler i 45 minutter. De 1 um Perlerne skal fortyndes til den ønskede koncentration i PBS. De 3 um perlerne skal adskilles fra opløsningen ved hjælp af stærke magneter, derefter genopløst i PBS. Denne proces skal gentages 3 gange. Vi har bemærket, at dette skridt er afgørende for get de 3 um perlerne at binde til overfladen immobiliseret collagen peptid.

4. Kraft Proteolyse Assay

  1. Når flowcellen samles med collagen peptid og magnetiske perler, billede flowcellen i det magnetiske fælden under lav, ~ 1 PN kraft. I vores erfaring, en subpopulation af perlerne undertiden svagt klæbet til overfladen på en ikke-specifik måde. Anvendelse af beskeden kraft sikrer, at disse perler er befriet.
  2. Tilsættes aktiveret enzym til flowcellen. I dette tilfælde MMP-1 blev præaktiveret ved tilsætning 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuriacetat) og inkuberet ved 37 ° C i 3 timer. Aktivering blev verificeret under anvendelse af SDS-PAGE.
  3. Så snart flowcellen er genindført i det magnetiske pincet apparat, optage en video, der spænder over et par synsfelter, typisk giver flere hundrede vedhæftede perler. Dette vil være t = 0.
  4. Gentag den samme proces med at optage flere synsfelter (mens tilbage to samme synsfelt) med regelmæssige tidspunkter, indtil alle perlerne løsnes eller ingen yderligere proteolyse skelnes.
  5. Kinetisk analyse af data
    1. Tæl perlerne i de forskellige områder af lyset på forskellige tidspunkter og gennemsnit dem. Normalisere antallet af perler ved at dividere den gennemsnitlige antal perler på hvert tidspunkt med antallet af perler ved t = 0. Dette sikrer, at man kan sammenligne priser for proteolyse fra forskellige eksperimenter, fordi det absolutte antal af perler vil variere fra eksperiment til eksperiment.
    2. Plotte forholdet som funktion af tiden. I dette tilfælde monteret vi det i et eksponentielt henfald plus en konstant.

    Ligning 3
    hvor f (t) er forholdet mellem perlerne fastgjort (eller collagenmolekyler unproteolyzed), t er tiden, a er den fraktion af perler fastgjort ved hjælp af en collagen tøjr, b er henfaldshastigheden konstant, og cer den fraktion af perler, der er fastgjort ikke-specifikt.

    1. Det samme eksperiment gentages med varierende styrke og MMP-1-koncentrationer for at belyse virkningen af ​​kraft på collagen proteolyse af MMP-1.

5. Repræsentative resultater

Den ovennævnte protokol beskrives en hidtil ukendt anvendelse af magnetiske pincet (fig. 1) for at studere virkningen af kraft på enzymatisk proteolyse. Vi kalibreret pincetten til 1 um og 3 um perler ved hjælp af både størrelsen af de observerede Brownske udsving og beregning af roll-off-frekvens ved varierende magnet positioner (figur 2). I kraft proteolyse eksperimenter, er konfigurationen tilsvarende, bortset fra at DNA er erstattet med collagen (fig. 3, 4). Den normaliserede antal perler resterende kan afbildes som funktion af tid til at finde den proteolyse hastigheder (fig. 5), og denne proces kangentages for forskellige enzymkoncentrationer og kræfter.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af den magnetiske fælden kalibrering (ikke målfast). To faste sjældne jordmagneter skabe et magnetfelt, der trækker på superparamagnetiske perler. At omsætte den magnet op og ned justerer den påførte kraft. Perlerne er afbildet ved hjælp af en konventionel lys-felt mikroskop med lyset, som passerer igennem et hul mellem de to magneter Indsat:. Billede taget med et 40x luft mål. De skarpe, runde pletter svarer til perlerne bundet til dækglas overfladen. De out-of-fokus objekter er løsrevne perler.

Figur 2
Figur 2. Kurver over kalibreret kraft som funktion af magnet afstand fra prøveoverfladen til 1 um (venstre) og 2,8 um (højre) perlesek. Data blev passer til den empiriske funktion Equation4 Hvor x er afstanden fra magneten. A = 31,8, b = 5,61 og C = 4,39 for 1 um perler og a = 140, b = 3,10 og C = 1,86 for de 3 um perlerne. Disse værdier er specifikke for vores specifikke instrument og eksperimenterende geometri, og hvert instrument bør kalibreres individuelt. Fejlsøjlerne ved hvert punkt repræsenterer en ~ 10% variation i påført kraft på en vulst til vulst basis på grund af variation i perlestørrelse. Den påførte kraft er proportional med volumenet af perlerne, og perlerumfanget varierer ~ 9% i den gennemsnitlige (ifølge producentens specifikationer).

Figur 3
Figur 3. Kraft proteolyse assay setup (ikke i skala). Kollagen model trimer er fastgjort til overfladen af dækglasset via mYC / anti-myc konjugering. De streptavidin-coatede superparamagnetiske kugler er fastgjort til collagen trimerer via en biotin-streptavidin-bindingen. Aktiverede MMP-1 skærer kollagen over tid forårsager, at perlerne løsnes fra overfladen og bevæge sig væk fra brændplanet.

Figur 4
Figur 4. Skematisk tegning af proteolyse som en funktion af tiden. Figuren viser et udsnit synsfelt over tid som proteolyse opstår. Over tid, løsnes MMP-1 skærer kollagen og perlerne og bevæge sig bort fra brændplanet under indflydelse af det magnetiske felt.

Figur 5
Figur 5. Proteolyse satser afhænger påførte kraft 16. Vist er data indsamlet på 1,0 pN (3 pM MMP-1, sort), 6,2 pN (3 pM MMP-1, rød) og 13 pN (0,2 uM MMP-1; mageNTA). De satser for proteolyse (fit parametre) er: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 PN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN), og 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). Den fraktion af perler unproteolyzed på lange tidspunkter (> 15 minutter) forbliver nogenlunde konstant på ~ 0,25 på tværs af forskellige eksperimenter. Fejlsøjler svarer til Poisson statistik afspejler antallet af observationer på hvert tidspunkt. Fejlen på hvert tidspunkt for n perler er n 1/2. Fejlen i fraktion af bundet beads blev beregnet ved en fejltagelse propagation.1 um perler blev anvendt til 1,0 PN og 6,2 PN eksperimenter og 2,8 um perler blev anvendt til 13 PN eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskrives en ny anvendelse af en klassisk enkelt molekyle teknik. Magnetiske pincet giver medium til høj kapacitet enkelt molekyle analyser på en omkostningseffektiv måde. Men ligesom alle eksperimentelle teknikker der er udfordringer og potentielle faldgruber.

Begrænsninger af magnetiske pincetter

Sammenlignet med en optisk fælde den rumlige og tidslige opløsning af en MT apparat er lav. Endvidere er de kræfter, der genereres af den simple MT her beskrevne 30 PN eller mindre, betydeligt mindre end kræfter rutinemæssigt tilgås i AFM eksperimenter. Denne begrænsning kan være en dyd: MT er velegnet til påføring sub-PN kræfter.

I modsætning til en optisk fælde eller AFM konventionel MT, såsom apparatet her, tillader ikke manipulation af individuelle partikler. Optiske fælder normalt anvendes til at påføre kraft parallel med dækglasset, mens MT er bedst egnet til lodrette trække eksperimenter. Electromagnetic MT tage fat på disse begrænsninger, men på bekostning af øget kompleksitet.

Pincet Kalibrering

Både Brownske udsving og magt spektrum analyse for kraft kalibrering har deres begrænsninger. Vi fandt, at den Brownske udsving metode er særligt følsom over for kamera slør. Som rammen steg (eksponeringstid reduceret) den beregnede kraft reduceres. I praksis har vi øget frame rate, indtil de kræfter, beregnet ud fra Brownske udsving aftalt med de kræfter, beregnet ved hjælp af magt spektret inden for 10%. Omvendt kraftspektret analysen er mere robust mod kamera slør, men lidt sværere at gennemføre. Vi anbefaler at udføre begge beregninger for at kontrollere, om resultaternes robusthed.

Vi bemærker, at variationer i perlestørrelse og magnetisk partikel indhold resulterer i variationer i påført kraft på ~ 10%. Denne effekt var ikke vigtigt i vores seneste eksperiment værefordi vi gennemsnit hundredvis af perler i hver måling. Imidlertid kunne eksperimenter, der udvinder unik information fra hver tøjret perle potentielt kræver en mere præcis kalibreringsmetode.

Kontrol for at sikre enkelt punkt vedhæftede filer

Opnåelse af specifikke, orienterede, single-point vedhæftede filer er ofte en praktisk udfordring i enkelt molekyle studier. De følgende kontroller bekræftet specifik binding af collagen til antistof, og perler til collagen:

  1. Tilsat perlerne til en strømningscelle passiveret med BSA.
  2. Tilsat anti-myc, passiverede med BSA og derefter tilsat perler.
  3. Tilsat anti-myc, passiveres med BSA, tilsat ikke-biotinyleret collagen og derefter tilsat perler.
  4. Passiveret med BSA, tilsat ikke-biotinyleret collagen og derefter tilsættes perlerne.
  5. Passivated med BSA, tilsat biotinyleret kollagen og derefter tilsat perler.
  6. Tilføjet anti-myc, passiviseret med BSA, tilsat biotinylated collagen og derefter tilsættes perlerne.

I tilfælde, 1-5, hvor en eller anden komponent af fastgørelsen serien blev bevidst udeladt, blev helst fra 0 til 4 perler set fastgjort til flowcellen pr synsfelt (80.000 um 2). Kun i tilfælde seks, hvor alle vedhæftningsgrupper er til stede, har vi ~~~HEAD=NNS 30-60 2,8 um perler og 80-200 1 um perler bundet til overfladen. Proteolysen kinetik observeret tilstrækkeligt egnet ved en enkelt eksponentiel plus en konstant periode, hvilket kraftigt antyder, at der kun er én hastighedsbegrænsende trin, og derfor kun en enkelt tøjr. Det konstante led afspejler sandsynligvis perler, der ikke-specifikt bundet til dækglas.

Vi rapporterer koncentrationer af antistof og protein, der arbejdede for vores eksperiment. Et bredt område af koncentrationer for hver komponent bør undersøges, når udviklingen af ​​en ny assay. BSA fungeret godt som overfladepassivering middel i vort eksperiment. Men dette er opfyldtHod fungerer muligvis ikke i alle tilfælde. Andre protokoller for overfladepassivering er også blevet anvendt med succes. Eksempler indbefatter polyethylenglycol funktionaliserede objektglas 17, der understøttes lipiddobbeltlag 18 eller kasein som et blokerende middel.

Bemærkninger om dataanalyse

I kraft proteolyse eksperimenter, er der altid en vis ikke-specifik frigørelse (især ved højere kræfter 19) på grund af dissociationen af ikke-kovalente (f.eks biotin - streptavidin) interaktioner. Vi tage højde for dette fænomen ved at måle proteolyse ved forskellige MMP-1-koncentrationer, herunder ikke MMP-1, som beskrevet i Adhikari et. al. Måling proteolyse ved forskellige MMP-1-koncentrationer for alle kræfter tillader os at generere Michaelis-Menten-kurver, hvor der anvendes til at beregne den katalytiske effektivitet kcat / M af enzymet. Alternativt, hvis forskellige koncentrationer af enzymet ikke anvendes, anbefales det, aten kontrolmåling udføres uden enzym ved de givne kræfter for at trække ud for ikke-specifik frigørelse.

Potentielle applikationer

De magnetiske pincet dækker et bredt varierer den gældende. De kræfter, der kan udøves afhænge af størrelsen af ​​perlerne. 1 um og 2,8 um perler overlapper tilgængelige kræfter, og i vores erfaring, enten ved hjælp af perlerne i de mellemliggende kræfter fungerer godt.

Vi forventer, at lignende eksperimentelle metoder kan være bredt anvendelig i at studere gældende afhængig proteolyse 4,20, udfolder 21 og bindende interaktioner 22. Vi og andre 23 har bemærket, at radius af diffraktion ringe for ude af fokus perler tilvejebringer et følsomt middel til sporing af positionen af perlen i forhold til dækglasset 23. Selv generelt ikke anvendes på denne måde, mener vi, at MT-assays har kapacitet til at tilvejebringe nanometer præcision MEAMålinger af protein strukturelle dynamik. Denne yderligere information kan være særlig værdifuld i forbindelse med force-afhængig proteolyse eller bindende mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Burroughs Wellcome Career Award på Den Videnskabelige Interface (ARD), National Institutes of Health via NIH direktørens New Innovator Award Program 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), og Stanford Cardiovascular Institute Younger Predoctoral Fellowship (JC). Forfatterne takker James Spudich for udlåner mikroskopi udstyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Cover Glass #1.5 (22x22) VWR 48366-067
Micro Cover Glass #1.5 (22x40) VWR 48393-048
Lambda DNA Invitrogen 25250-010
T4 DNA Ligase Invitrogen 15224-041
Microcon Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-Digoxigenin Roche Diagnostics 11-333-089-001
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Anti-myc Antibody Invitrogen 46-0603
Bovine Serum Albumin Sigma B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin Invitrogen 658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetate Calbiochem 164610
Biotin-Maleimide Sigma Aldrich B1267
Biotin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Digoxigenin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Collagen peptide gene DNA 2.0 Custom synthesis
MMP-1 cDNA Harvard Plasmid Database
z-translator Thorlabs MTS50
Servo controller for translator Thorlabs TDC001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
  3. Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
  4. Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
  5. Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
  6. Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
  7. Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
  8. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  9. Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
  10. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  11. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
  13. Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
  14. Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
  15. Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
  16. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  17. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  18. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
  19. Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
  20. Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
  21. Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
  22. del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
  23. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).

Tags

Bioengineering Chemical Engineering fysik Single-molekyle spektroskopi magnetiske pincet kraft proteolyse collagen MMP-1
Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A.… More

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (65), e3520, doi:10.3791/3520 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter