Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett

Published: July 25, 2012 doi: 10.3791/3520
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

Summary

I den här artikeln beskriver vi användandet av magnetiska pincett för att studera effekten av kraft på enzymatisk proteolys vid den enda molekyl nivå på ett mycket parallelliserbart sätt.

Abstract

Generering och detektering av mekaniska krafter är en allestädes närvarande del av cellens fysiologi, med direkt relevans för cancer metastaser 1, aterogenes 2 och sårläkning 3. I vart och ett av dessa exempel, celler både utövar kraft på sin omgivning och samtidigt enzymatiskt remodel den extracellulära matrisen (ECM). Effekten av krafter på ECM har därmed blivit ett område av stort intresse på grund av dess sannolika biologiska och medicinsk betydelse 4-7.

Enda molekyl tekniker såsom optisk svällning 8, atomkraftsmikroskopi 9, och magnetiska pincett 10,11 låta forskare att undersöka funktionen hos enzymer på molekylär nivå genom att utöva krafter på enskilda proteiner. Av dessa tekniker, magnetiska pincett (MT) är anmärkningsvärda för sin låga kostnad och hög genomströmning. MT utövar krafter i intervallet ~ 1-100 PN och kan ge millisekund temporal upplösning,kvaliteter som är väl anpassade till att studera enzym-mekanism på en enda molekyl nivå 12. Här rapporterar vi en mycket parallelliserbart MT-analys för att studera effekten av kraft på proteolys av enstaka proteinmolekyler. Vi presenterar det särskilda exemplet av proteolys av en trimer kollagen peptid av matrismetalloproteinasaktivitet 1 (MMP-1), men kan denna analys kan enkelt anpassas för att studera andra substrat och proteaser.

Protocol

1. Flödescell Framställning

  1. Täckglas (# 1.5, 22x22 mm och 22x40 mm, VWR) rengörs med ultraljud.
    1. Tillsätt täckglasen till en liten glasbehållare i stånd att hålla täckglasen och inpassning i sonikator (se steg 2).
    2. Fylla behållaren med isopropanol och sonikera under en badsonikator under 20 minuter.
    3. Kasta isopropanol och skölj täckglasen med rikliga mängder avjoniserat vatten som produceras av en Barnsted MilliQ apparat eller liknande anordning. Fylla behållaren med vatten och sonikera under 20 minuter.
    4. Efter ultraljudsbehandling, torka täckglasen i en ström av filtrerad, dammfri luft. Använd endast täckglas som visas rent (dvs. inga fläckar).
    5. Försiktigt eld täckglasen under några sekunder att rengöra dem kvarvarande damm och fukt: passera täckglasen genom en gaslåga produceras med en Bunsenbrännare, noga med att inte förvränga täckglaset på grund av överskottsvärme. Detta steg avlägsnar kvarvarande ytanföroreningar.
  2. Använda dubbelsidig tejp, fast de två täckglas tillsammans. Skära av bandet ~ 3 cm i längd och 0,3 cm i bredd. Fästa tejpen på 22x40 mm täckglas lämnande en 1,6 cm kanal i mitten. Använd en pipettspets för att försiktigt trycka ned på täckglaset för att se till att bandet verkligen har anslutit sig till.

2. Magnetisk pincett Setup och kalibrering

  1. Magnetiska pincett var inställning med permanenta sällsynta jordartsmetaller magneter som beskrivits tidigare 10,12. En aluminium-L-hållare konstruerades med en 1 mm diameter hål och är monterad på en vertikal z-översättare (Thorlabs) för att modulera höjd av pincett. Två permanenta sällsynta jordartsmetallmagneter har fäst vid fästet på vardera sidan av den lilla öppningen för att skapa den magnetiska fällan (figur 1).
  2. DNA-beredning: DNA från lambda fag-märkt vid dess 5 'och 3' ändarna gjordes med biotin och digoxigenin (IDT-DNA, San Diego, CA) användes för att kalibrera magtiska pincett.
    1. Blanda 50 ^ il av 4 nM λ-DNA med 2 | il av 40 nM biotin-konjugerad oligonukleotid och värm vid 60 ° C under 10 minuter. Därefter långsamt svalna till rumstemperatur över 1 timme.
    2. Tillsätt-DNA-ligas i enlighet med tillverkarens specifikationer och ligera vid rumstemperatur under 3 timmar.
    3. Tillsätt 2 | il av 400 nM digoxigenin konjugerad oligonukleotid och inkubera vid rumstemperatur under 45 minuter.
    4. Tillsätt 1,5 pl av 10 mM ATP och fortsätter ligering av digoxigenin konjugerad oligonukleotiden till λ-DNA i 3 timmar.
    5. Avlägsnande av överskott av oligonukleotider och DNA-ligas med användning av 100 kDa-filter centrifugering (Microcon UltraCell YM-100). Totalt 1000-faldigt buffertbyte i TE-buffert är tillräcklig för att avlägsna överskottet av oligos. OBS: Det är viktigt att inte använda spin hastigheter> 500xg eftersom det kommer att leda till skjuvning av DNA.
    6. Undersöka ett prov av DNA via elektrofores på en 0,7% agarosgel för att säkerställa att DNA: t is denatureras inte eller klippt.
    7. Mäta koncentrationen av DNA. Användningen av en NanoDrop UV-Vis-spektrometer (Thermo Scientific) rekommenderas eftersom den tillgängliga prowolymen kan vara mycket liten.
  3. Förbered flödescellerna som beskrivs i avsnitt 1.
  4. För fastsättning av DNA till flödescellen, tillsätt anti-digoxigenin-antikropp (får-IgG; 1 pg ml -1; Roche Bioscience, Mannheim, Tyskland) och tillåta den att vidhäfta till glasytan i 15 minuter.
  5. Passivera ytan av flödescellen för att förhindra icke-specifik vidhäftning av DNA genom tillsats av 2 mg ml -1 BSA, 0,1% Tween-20 i 1 x PBS. Inkubera vid rumstemperatur under 45 minuter.
  6. Upprepa steg 2,5.
  7. Tillsätt 50 pM av fuctionalized λ-DNA och medge att fästa vid täckglas i 15 minuter.
  8. Tvätta bort överflödigt DNA med 1x PBS.
  9. Lägg streptavidintäckta superparamagnetiska pärlor (1 nm kulor = 2 ng ml -1, 2,8 um pärlor = 20 ng ml -1
  10. Tvätta bort överskott pärlor med 1x PBS.
  11. Magnetisk pincett Kalibrering
    1. Flytta de permanenta magneterna till en position som är långt borta från provets yta (> 15 mm).
    2. Placera den förbehandlade flödescellen i mikroskopet.
    3. Flytta de permanenta magneterna i läge ovanför flödescellen.
    4. Välj fokalplan λ-DNA functionalized pärlor genom att fokusera på kulorna bort från båda glasytor. Den korrekta fokalplanet är en i vilken de önskade pärlorna har en ljust centrum.
    5. Ta en video sträng rörelse vid 80 Hz eller högre för 500 ramar.
    6. Flytta magneten närmare provets yta. För avstånd utöver 5 mm, röra sig i steg om 1 mm. För avstånd mellan 1 och 5 mm, röra sig i 0,5 mm steg. För avstånd mindre än 1 mm, röra sig i 0,25 mm steg.
    7. Upprepa steg 2.11.5 och 2.11.6 vid varje ny magnet position.
    8. För varje dataställts in, spåra mitten av pärlorna med en 2D Gaussisk passform.
    9. Beräkna kraften via Brownsk fluktuationer med:

    Ekvation 1
    där k B T är Boltzmanns värmeenergi, L är längden av λ-DNA, och <x 2> är variansen i centroiden läge.

    1. Bekräfta riktigheten av de krafter genom att kontrollera den kraft beräkningen via en kraftspektrum Lorentz passning för att hitta den rolloff frekvensen. Påförd kraft är relaterad till den rolloff-frekvens genom förhållandet:

    Ekvation 2
    Där ƒ 0 är rolloff-frekvensen, är en vulsten radie och μ är vätskans viskositet 12.

3. Kollagen Peptid Tillägg till flödesceller

För att ge ett konkret exempel på tillämpning av vår metodik, beskriver vi senare arbete i vårt laboratorium som präglar proteolys av en trimer kollagen modell peptid. Vi räknar med att denna allmänna strategi i stort sett kan tillämpas på andra proteiner och polynukleotider.

  1. Kollagenet modell peptiden består av en N-terminal 6x His-tag för rening, följt av en 5 x myc-tag, (GPP) 10 för att upprätthålla trippelhelixbildning, kollagen a1 rester 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), som utgör den MMP- 1 igenkänningsställe, den foldon sekvensen (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), och en C-terminal KKCK att underlätta märkning med biotin-maleimid. Foldon härrör från T4-fag-proteinet fibritin, och stabiliserar trimerer kollagen modell när de fuseras vid antingen N - eller C-terminalen 13,14.
  2. Den kollagen-peptid och MMP-1-proteiner uttrycktes och renades såsom beskrivits tidigare 4,15. </ Li>
  3. Tillsätt-anti-myc (15 | ig ml -1) till flödescellen och inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter så att anti-myc för att fästa till ytan av flödescellen.
  4. Passivera flödescellen för att förhindra icke-specifik bindning av proteiner med användning av 5 mg ml -1 BSA på samma sätt såsom beskrivs i steg 2.5.
  5. Tillsätt 150 peptid pM kollagen och låt det att fästa till antikroppen via myc tagg för 45 minuter.
  6. Tvätta bort överflödigt kollagen med PBS-buffert.
  7. Lägg streptavidinbelagda superparamagnetiska pärlor (1 nm kulor = 2 pg ml -1 och 2,8 um pärlor = 20 ng ml -1) och låta dem att fästa till kollagen molekyler för 45 minuter. De 1 fim pärlorna skall spädas till den önskade koncentrationen i PBS. De 3 ^ m pärlor bör separeras från lösningen med användning av starka magneter, och återupplöstes sedan i PBS. Denna process bör upprepas 3 gånger. Vi märkte att detta steg är nödvändigt för GEt de 3 jim pärlorna att binda till yt-immobiliserade kollagen peptid.

4. Kraft Proteolys Analys

  1. När flödet cellen monteras med kollagen peptid och magnetiska pärlor, bild flödescellen i den magnetiska fällan under låg, ~ 1 pN kraft. Enligt vår erfarenhet är en subpopulation av pärlor ibland svagt häftade till ytan på ett icke-specifikt sätt. Tillämpningen av blygsamma kraft ser till att dessa pärlor frigörs.
  2. Tillsätt aktiverat enzym till flödescellen. I detta fall MMP-1 föraktiveras genom tillsats 3,5 mM APMA (4-aminofenylkvicksilveracetat) och inkuberades vid 37 ° C under 3 timmar. Aktiveringen verifierades med användning av SDS-PAGE.
  3. Så snart flödet cellen åter införs i den magnetiska pincetten apparaten, spela in en video som spänner några synfält, vanligen ger flera hundra anslutna pärlor. Detta kommer att vara T = 0.
  4. Upprepa samma process för registrering flera synfält (medan återvänder to samma synfält) med regelbundna tidpunkter, tills alla pärlorna lossna eller inte längre proteolys skönjas.
  5. Kinetisk dataanalys
    1. Räkna pärlorna i de olika synfält vid olika tidpunkter och i genomsnitt dem. Normalisera antalet kulor genom att dividera den genomsnittliga antalet pärlor vid varje tidpunkt med antalet pärlor vid t = 0. Detta säkerställer att vi kan jämföra priser från proteolys från olika experiment, eftersom det absoluta antalet pärlor varierar från experiment till experiment.
    2. Plotta förhållandet som en funktion av tiden. I detta fall monteras vi att en exponentiell avklingning plus en konstant.

    Ekvation 3
    där f (t) är förhållandet av pärlorna bundna (eller kollagenmolekyler unproteolyzed), t är tiden, är en av fraktionen av pärlor bundna av en kollagen tjuder, b är avklingningshastigheten konstant, och cär den fraktion av pärlor som är fästa icke-specifikt.

    1. Samma experiment upprepades vid varierande kraft och MMP-1-koncentrationer för att belysa effekten av kraft på kollagen proteolys av MMP-1.

5. Representativa resultat

Det ovanstående protokollet beskriver en ny användning av magnetiska pincett (figur 1) för att studera effekten av kraften på enzymatisk proteolys. Vi kalibrerade pincetten för 1 m och 3 pm pärlor med både storleken av de observerade Brownsk fluktuationer och beräkning av roll-off frekvens vid olika knappar positioner (Figur 2). I experimenten kraften proteolys är installationsproceduren liknande förutom att DNA är ersatt med collagen (figurerna 3, 4). Den normaliserade antalet pärlor återstående kan ritas som funktion av tiden för att hitta de proteolys satser (figur 5), och denna process kan varaupprepas för olika enzymkoncentrationer och krafter.

Figur 1
Figur 1. Schematisk ritning av magnetisk fälla kalibreringsprocessen (ej i skala). Två permanenta sällsynta jordartsmetallmagneter skapa ett magnetfält som drar i det superparamagnetiska pärlor. Översätta magneten upp och ned justerar den anbringade kraften. Pärlorna avbildas genom att använda en konventionell ljusfält mikroskop med det ljus som passerar genom en por mellan de två magneterna Inset:. Bild tagen med en 40x luft mål. De skarpa, runda fläckar motsvarar pärlorna bundna till täckglaset yta. De out-of-fokus objekt är fristående pärlor.

Figur 2
Figur 2. Kurvor över det kalibrerade kraft som en funktion av magneten avstånd från provytan till 1 ^ m (vänster) och 2,8 ^ m (höger) beads. Data passa den empiriska funktionen Equation4 , Där x är avståndet från magneten. En = 31,8, b = 5,61, och c = 4,39 för de 1 ^ m pärlor och en = 140, b = 3,10 och c = 1,86 för de 3 ^ m pärlor. Dessa värden är specifika för våra specifika instrument och experimentell geometri, och varje instrument bör kalibreras individuellt. Felstaplarna vid varje punkt representerar ett ~ 10% variation i applicerade kraften på en vulst till vulst grund, på grund av variabiliteten i pärlstorlek. Den kraft som appliceras är proportionell mot volymen av pärlorna, och vulsten volym varierar ~ 9% under medelvärdet (enligt tillverkarens specifikationer).

Figur 3
Figur 3. Force proteolys analys installation (ej skalenlig). Kollagenet modell trimeren är fäst till ytan av täckglaset via mYC / anti-myc konjugering. De streptavidinbelagda superparamagnetiska pärlor är fästa till kollagen trimerer via en biotin-streptavidin-bindning. Aktiverat MMP-1 skär kollagen med tiden, vilket orsakar pärlorna att lossna från ytan och förflyttas bort från fokalplanet.

Figur 4
Figur 4. Schematisk tecknad av proteolys som en funktion av tiden. Serien visar ett exempel synfält över tiden som proteolys sker. Över tiden, MMP-1 skär kollagen och pärlorna lösgöra och avlägsna sig från fokalplanet under inverkan av det magnetiska fältet.

Figur 5
Figur 5. Proteolys priser beror på anbringad kraft 16. Som visas är data som samlas in 1,0 pN (3 M MMP-1, svart), 6,2 pN (3 M MMP-1, röd) och 13 pN (0,2 M MMP-1; mageNTA). Frekvensen av proteolys (passar parametrar) är: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 PN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN) och 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). Den fraktion av pärlor unproteolyzed på långa tidpunkter (> 15 minuter) är ungefär konstant vid ~ 0,25 i olika experiment. Felstaplar motsvarar Poisson statistik återspeglar antalet observationer vid varje tidpunkt. Felet vid varje tidpunkt för n-pärlor är n 1/2. Felet i fraktionen av bifogade pärlor beräknades av misstag propagation.1 um pärlor användes för 1,0 PN och 6.2 pN experiment och 2,8 pärlor jim användes för 13 pN experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en ny användning för en klassisk enda molekyl teknik. Magnetiska pincett kan medelhög till hög kapacitet enda molekyl analyser i ett kostnadseffektivt sätt. Men liksom alla experimentella tekniker det finns utmaningar och potentiella fallgropar.

Begränsningar av magnetiska pincetter

Jämfört med en optisk fälla den rumsliga och tidsmässiga upplösningen av en MT anordning är låg. Vidare är de krafter som genereras av den enkla MT som beskrivs här är 30 PN eller mindre, vilket är betydligt mindre än krafterna som rutinmässigt nås i AFM experiment. Denna begränsning kan vara en dygd: MT är väl lämpade för att tillämpa sub-PN krafter.

Till skillnad från en optisk fälla eller AFM, konventionell MT, såsom den apparat här, tillåter inte manipulering av individuella partiklar. Optiska fällor vanligen används för att applicera kraft parallellt med täckglaset, medan MT är bäst lämpade för vertikala dra experiment. Electromagnetic MT ta itu med dessa begränsningar, men på bekostnad av ökad komplexitet.

Pincetten Kalibrering

Både Brownsk fluktuationer och makt spektrumanalys för kraft kalibrering har sina begränsningar. Vi fann att den Brownska fluktuationer metoden är särskilt känslig för kameran oskärpa. Eftersom ramen ökade (exponeringstid minskat) den beräknade kraften minskat. I praktiken ökade vi bildhastighet tills krafterna som beräknats från Brownsk fluktuationer överens med de krafter beräknade med hjälp av effektspektrumet inom 10%. Omvänt är makten spektrumanalys mer robust mot kameran oskärpa, men något svårare att genomföra. Vi rekommenderar utför både beräkningar för att kontrollera tillförlitligheten av resultaten.

Vi noterar att variationer i kula storlek och magnetiska partiklar innehåll resulterar i variationer i kraft på ~ 10%. Denna effekt var inte viktigt i vår senaste experiment atteftersom vi i genomsnitt under hundratals pärlor i varje mätning. Kan dock experiment som utvinner unik information från varje bunden pärla kräver ett potentiellt mer noggrann kalibrering.

Kontroller för att säkerställa single point bilagor

Att uppnå specifika, orienterade, single-point bilagor är ofta en praktisk utmaning i enda molekyl studier. Följande kontroller bekräftade specifika bindning av kollagen för att antikroppar och pärlor till kollagen:

  1. Tillsattes bara pärlor till en flödescell passiveras med BSA.
  2. Lade anti-myc, passiverad med BSA och sedan pärlor.
  3. Lade anti-myc, passiveras med BSA, tillsats av andra biotinylerad kollagen och sedan pärlor.
  4. Passiveras med BSA, tillsattes icke-biotinylerad kollagen och därefter tillsätts pärlor.
  5. Passiveras med BSA, tillade biotinylerad kollagen och sedan lagt pärlor.
  6. Lade anti-myc, passiveras med BSA, tillägger biotinylated kollagen och därefter tillsätts pärlor.

I de fall 1-5, där någon komponent i den bifogade filen serien medvetet utelämnas togs allt från 0 till 4 kulor ses ansluten till flödescellen per synfält (80000 m 2). Endast i fall 6, där alla anslutningskrav delarna finns, såg vi ~~~HEAD=NNS 30-60 2,8 um pärlor och 80-200 1 pm pärlor fästa till ytan. Proteolysen kinetik observerades tillräckligt plats av en enda exponentiell plus en konstant term, vilket starkt tyder på att det bara finns en hastighetsbegränsande steget, och därmed endast en tjuder. Den konstanta termen återspeglar sannolikt pärlor som är icke-specifikt bunden till täckglaset.

Vi rapporterar koncentrationerna av antikropp och protein som arbetade för vårt experiment. Ett brett intervall av koncentrationer för varje komponent bör undersökas vid utveckling av en ny analys. BSA fungerade bra som ett ytpassivering medel i vårt experiment. Men mötte dennahod kanske inte fungerar under alla omständigheter. Andra protokoll för ytpassivering har också använts med framgång. Exempel innefattar polyetylenglykol funktionaliserade glasskivor 17, som stöds lipiddubbelskikt 18 eller kasein som ett blockeringsmedel.

Att tänka på dataanalys

I experiment kraft proteolys, finns det alltid en viss icke-specifik lösgörande (speciellt vid högre krafter 19) på grund av dissociation av icke-kovalenta (t.ex. biotin - streptavidin) interaktioner. Vi står för detta fenomen genom att mäta proteolys vid olika MMP-1-koncentrationer, inklusive inte MMP-1, som beskrivs i Adhikari et. fl. Mätning proteolys vid olika MMP-1-koncentrationer för alla krafter tillåter oss att generera Michaelis-Menten-kurvor, där används för att beräkna den katalytiska effektiviteten kcat / Km för enzymet. Alternativt, om olika koncentrationer av enzymet inte används, rekommenderas atten kontroll mätning göras utan enzym vid de givna krafter för att subtrahera bort en hastighet av icke-specifik lösgörande.

Potentiella tillämpningar

De magnetiska pincetter täcker ett brett kraft område. De krafter som kan utövas bero på storleken hos pärlorna. 1 m och 2,8 pärlor im överlappar varandra i tillgängliga krafter, och i vår erfarenhet, att använda någon av pärlorna vid mellanliggande krafter fungerar bra.

Vi räknar med att liknande experimentella metoder kan vara i stort sett tillämpas för att studera gällande beroende proteolys 4,20, utbredning 21 och bindningsinteraktioner 22. Vi och andra 23 har noterat att radien av diffraktion ringar för av fokus pärlor ger en känslig medel för att spåra position pärlan i förhållande till täckglaset 23. Även i allmänhet inte användas på detta sätt tror vi att MT analyser har kapacitet att ge nanometer precision åtgärstämmer för av protein strukturella dynamiken. Denna ytterligare information kan vara särskilt värdefullt i samband med kraft-beroende proteolys eller bindande mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Burroughs Wellcome Karriär Award på den vetenskapliga Interface (ARD), National Institutes of Health genom NIH direktörens Nya Innovatör Award Program 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ) och Stanfords Kardiovaskulär Institute dy Predoctoral Fellowship (JC). Författarna tackar James Spudich för att låna ut mikroskopi utrustning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Cover Glass #1.5 (22x22) VWR 48366-067
Micro Cover Glass #1.5 (22x40) VWR 48393-048
Lambda DNA Invitrogen 25250-010
T4 DNA Ligase Invitrogen 15224-041
Microcon Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-Digoxigenin Roche Diagnostics 11-333-089-001
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Anti-myc Antibody Invitrogen 46-0603
Bovine Serum Albumin Sigma B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin Invitrogen 658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetate Calbiochem 164610
Biotin-Maleimide Sigma Aldrich B1267
Biotin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Digoxigenin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Collagen peptide gene DNA 2.0 Custom synthesis
MMP-1 cDNA Harvard Plasmid Database
z-translator Thorlabs MTS50
Servo controller for translator Thorlabs TDC001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
  3. Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
  4. Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
  5. Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
  6. Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
  7. Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
  8. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  9. Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
  10. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  11. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
  13. Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
  14. Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
  15. Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
  16. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  17. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  18. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
  19. Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
  20. Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
  21. Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
  22. del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
  23. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).

Tags

Bioteknik kemiteknik fysik enda molekyl spektroskopi magnetiska pincetter kraft proteolys kollagen MMP-1
Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A.… More

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (65), e3520, doi:10.3791/3520 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter