Summary
इस अनुच्छेद में हम चुंबकीय चिमटी का उपयोग करने के लिए एक अत्यधिक parallelizable तरीके से एक अणु के स्तर पर एंजाइमी proteolysis पर बल के प्रभाव का अध्ययन का वर्णन.
Abstract
और यांत्रिक बलों की पीढ़ी का पता लगाने सेल फिजियोलॉजी का एक देशव्यापी पहलू कैंसर 1 मेटास्टेसिस, मेदार्बुदजनन 2 और 3 घाव को भरने के लिए प्रत्यक्ष प्रासंगिकता के साथ है. इन उदाहरणों में से प्रत्येक में, कोशिकाओं दोनों अपने परिवेश पर बल डालती है और एक साथ enzymatically बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) फिर से तैयार करना. ईसीएम पर सेना का प्रभाव इस प्रकार काफी इसकी संभावना जैविक और चिकित्सा 4-7 महत्व की वजह से ब्याज की एक क्षेत्र बन गया है.
जैसे ऑप्टिकल फँसाने 8, परमाणु शक्ति 9 माइक्रोस्कोपी, और चुंबकीय चिमटी 10,11 एकल अणु तकनीक शोधकर्ताओं व्यक्तिगत प्रोटीन पर बल exerting द्वारा एक आण्विक स्तर पर एंजाइमों के समारोह की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं. इन तकनीकों का चुंबकीय चिमटी (एमटी) को उनके कम लागत और उच्च throughput के लिए उल्लेखनीय हैं. मीट्रिक टन की ~ पी.एन. 1-100 रेंज में सेना डालती है और millisecond के अस्थायी समाधान प्रदान कर सकते हैं,गुण है कि अच्छी तरह से एकल अणु के स्तर पर 12 एंजाइम तंत्र का अध्ययन करने के लिए मिलान कर रहे हैं. यहाँ हम एक अत्यधिक parallelizable मीट्रिक टन परख के लिए एक प्रोटीन अणु की proteolysis पर बल के प्रभाव का अध्ययन रिपोर्ट. हम मैट्रिक्स metalloproteinase 1 (एमएमपी 1) द्वारा एक से trimeric कोलेजन पेप्टाइड proteolysis के विशिष्ट उदाहरण प्रस्तुत करते हैं, तथापि, यह परख आसानी से करने के लिए अन्य substrates और proteases का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.
Protocol
1. प्रवाह सेल तैयार
- Coverslips (1.5 # 22x22 मिमी और 22x40 मिमी, VWR) के sonication का उपयोग कर साफ कर रहे हैं.
- एक छोटा गिलास कंटेनर coverslips पकड़ और sonicator में फिटिंग (चरण 2 देखें) का सक्षम coverslips जोड़ें.
- Isopropanol साथ कंटेनर भरें और 20 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में sonicate.
- Isopropanol त्यागें और विआयनीकृत Barnsted MilliQ उपकरण या इसी तरह की डिवाइस के द्वारा उत्पादित पानी की प्रचुर मात्रा के साथ coverslips कुल्ला. पानी के साथ कंटेनर भरें और 20 मिनट के लिए sonicate.
- Sonication के बाद, फ़िल्टर, धूल से मुक्त हवा की एक धारा में coverslips सूखी. केवल coverslips कि साफ दिखाई देते हैं (यानी कोई smudges) का उपयोग करें.
- लौ धीरे कुछ सेकंड के लिए coverslips उन्हें किसी भी शेष धूल और नमी की साफ करने के लिए: coverslips गैस एक लेम्प बर्नर के साथ उत्पादन लौ के माध्यम से गुजरती हैं, देखभाल करने के लिए अतिरिक्त गर्मी के कारण coverslip ताना नहीं है. इस कदम अवशिष्ट सतह को हटाcontaminants के.
- डबल पक्षीय स्कॉच टेप का प्रयोग, दो coverslips साथ देते हैं. टेप कट ~ लंबाई में 3 सेमी और चौड़ाई में 0.3 सेमी. 22x40 मिमी के बीच में एक 1.6 सेमी चैनल छोड़ने coverslip पर टेप देते हैं. एक विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए धीरे coverslip पर नीचे प्रेस करने के लिए सुनिश्चित करें कि टेप ठीक से पालन किया है.
2. चुंबकीय चिमटी सेटअप और अंशांकन
- चुंबकीय चिमटी स्थायी दुर्लभ पृथ्वी चुंबक का उपयोग कर के रूप में पहले से 10,12 वर्णित सेटअप थे. 1 मिमी व्यास pinhole एल कोष्ठक के साथ एक एल्यूमीनियम का निर्माण किया गया था और एक ऊर्ध्वाधर (Thorlabs) z-अनुवादक चिमटी की ऊंचाई मिलाना पर घुड़सवार. दो स्थायी मैग्नेट दुर्लभ पृथ्वी के चुंबकीय जाल (चित्रा 1) बनाने के लिए pinhole के दोनों ओर पर कोष्ठक से जुड़े थे.
- डीएनए तैयारी: बायोटिन और digoxigenin (IDT डीएनए, सैन डिएगो, CA) के साथ समाप्त होता है लैम्ब्डा अपने 5 'और 3' में लेबल फेज से डीएनए पत्रिका जांचना इस्तेमाल किया गया थाnetic चिमटी.
- 10 मिनट के लिए 40 संयुग्मित oligonucleotide और 60 में गर्मी डिग्री सेल्सियस बायोटिन एनएम 2 μL के साथ 4 एनएम λ डीएनए के 50 μL मिश्रण. फिर धीरे से 1 घंटे से अधिक कमरे के तापमान पर ठंडा.
- निर्माता विनिर्देशों के अनुसार डीएनए ligase जोड़ें और 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कटी घमनी को बांधना.
- 2 400 एनएम digoxigenin संयुग्मित और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर oligonucleotide सेते हैं μL जोड़ें.
- 10 मिमी एटीपी 1.5 μL जोड़ें और λ - डीएनए को 3 घंटे के लिए digoxigenin संयुग्मित oligonucleotide के बंधाव जारी.
- अतिरिक्त oligonucleotides है और डीएनए ligase 100 केडीए स्पिन फिल्टर (Microcon Ultracell YM-100) का उपयोग कर निकालें. 1000 गुना ते बफर बफर विनिमय की कुल अतिरिक्त oligos को दूर करने के लिए पर्याप्त है. नोट: यह महत्वपूर्ण है करने के लिए स्पिन> गति 500xG उपयोग नहीं है क्योंकि यह डीएनए की कर्तन के लिए नेतृत्व करेंगे.
- 0.7% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से डीएनए के नमूने की जांच करना है कि डीएनए मैं करने के लिए सुनिश्चित करेंएस विकृत या sheared नहीं है.
- डीएनए की एकाग्रता को मापने. Nanodrop स्पेक्ट्रोमीटर यूवी विज़ (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग की सिफारिश की है क्योंकि उपलब्ध नमूना मात्रा बहुत छोटा हो सकता है.
- प्रवाह कोशिकाओं की तैयारी खंड 1 में वर्णित के रूप में.
- प्रवाह सेल करने के लिए डीएनए के अनुलग्नक के लिए, विरोधी digoxigenin के एंटीबॉडी (भेड़ आईजीजी, 1 μg एमएल -1, रॉश बायोसाइंस, Manheim, जर्मनी) और यह 15 मिनट के लिए कांच की सतह का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.
- प्रवाह सेल की सतह लिए 1x पीबीएस में 2 मिलीग्राम एमएल -1 बीएसए, 0.1% के बीच 20 जोड़ने के द्वारा गैर विशिष्ट डीएनए की चिपके को रोकने के Passivate. 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 2.5 कदम दोहराएँ.
- Fuctionalized λ डीएनए की 50 बजे जोड़ें और 15 मिनट के लिए coverslip करने के लिए अनुमति देते हैं.
- 1x पीबीएस के साथ अतिरिक्त डीएनए दूर धो लें.
- 2.8 माइक्रोन मोती = 20 μg एमएल के -1, streptavidin लेपित superparamagnetic (मोती 1 माइक्रोन मोती = 2 μg -1 एमएल जोड़ें
- दूर 1x पीबीएस के साथ अतिरिक्त मोती धो लें.
- चुंबकीय चिमटी अंशांकन
- एक स्थिति है कि नमूना सतह (> 15 मिमी) से दूर है स्थायी मैग्नेट ले जाएँ.
- माइक्रोस्कोप में तैयार प्रवाह सेल रखें.
- प्रवाह सेल ऊपर की स्थिति में स्थायी चुंबक ले जाएँ.
- दोनों गिलास सतहों से दूर मोती पर ध्यान केंद्रित करके λ डीएनए functionalized मोतियों के फोकल हवाई जहाज़ चुनें. सही फोकल हवाई जहाज़ में जो वांछित मोती एक उज्जवल केन्द्र है.
- 80 या 500 फ्रेम के लिए हर्ट्ज अधिक से अधिक पर मनका गति के एक वीडियो ले लो.
- चुंबक नमूना की सतह के करीब ले जाएँ. 5 मिमी से परे दूरी के लिए, 1 मिमी वेतन वृद्धि में कदम. 1 और 5 मिमी के बीच की दूरी के लिए, 0.5 मिमी वेतन वृद्धि में कदम. 1 मिमी से भी कम दूरी के लिए, 0.25 मिमी की वेतन वृद्धि में कदम.
- प्रत्येक नई चुंबक स्थिति में 2.11.5 और 2.11.6 कदम दोहराएँ.
- प्रत्येक डेटा के लिएसेट करने के लिए, एक 2d गाऊसी फिट का उपयोग कर मोतियों की केंद्र ट्रैक.
- ब्राउनियन का उपयोग उतार चढ़ाव के माध्यम से बल की गणना:
जहां कश्मीर बी टी बोल्ट्जमान थर्मल ऊर्जा है, एल λ डीएनए की लंबाई है, और <x 2>, केन्द्रक स्थिति में अंतर है.- एक शक्ति स्पेक्ट्रम Lorentzian फिट के माध्यम से बल गणना की जाँच के क्रम में rolloff आवृत्ति खोजने बलों की सटीकता की पुष्टि करें. एप्लाइड बल संबंध द्वारा rolloff आवृत्ति से संबंधित है:
जहां ƒ 0 rolloff आवृत्ति है, मनका त्रिज्या है, और μ द्रव 12 दलदलापन है.
3. कोलेजन पेप्टाइड फ्लो सेल अनुलग्नक
आदेश में हमारी पद्धति के आवेदन के लिए एक ठोस उदाहरण प्रदान करने के लिए, हम हमारी प्रयोगशाला में ही काम है कि एक से trimeric कोलेजन मॉडल पेप्टाइड का proteolysis की विशेषता का वर्णन है. हम आशा करते हैं कि यह सामान्य दृष्टिकोण मोटे तौर पर अन्य प्रोटीन और polynucleotides के के लिए लागू किया जा सकता है.
- कोलेजन मॉडल पेप्टाइड एन टर्मिनल 6x शुद्धि, एक 5x myc टैग, (GPP) 10 ट्रिपल हेलिक्स गठन को लागू करने के लिए, कोलेजन के बाद के लिए उनके टैग के होते हैं α1 772-786 अवशेष (GPQGIAGQRGVVGL) के, जो के रूप में मिशन मोड परियोजना 1 मान्यता साइट, foldon अनुक्रम (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) के, और एक सी टर्मिनल KKCK बायोटिन maleimide साथ लेबलिंग की सुविधा. Foldon प्रोटीन टी -4 फेज fibritin से निकला, और कोलेजन मॉडल trimers स्थिर है जब या तो एन में जुड़े हुए या 13,14 सी टर्मिनस.
- कोलेजन पेप्टाइड और एमएमपी-1 प्रोटीन व्यक्त की है और शुद्ध रूप में 4,15 पहले से वर्णित <./ Li>
- विरोधी myc प्रवाह सेल की सतह को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के विरोधी myc (15 μg एमएल -1) प्रवाह सेल और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं जोड़ें.
- प्रवाह सेल Passivate गैर विशिष्ट प्रोटीन का एक ही रास्ता में 5 मिलीग्राम एमएल -1 बीएसए का उपयोग कर के रूप में 2.5 चरण में वर्णित लगाव को रोकने के.
- 150 PM कोलेजन पेप्टाइड जोड़ें और myc टैग के माध्यम से 45 मिनट के लिए एंटीबॉडी के लिए अनुमति देते हैं.
- दूर अतिरिक्त पीबीएस बफर का उपयोग कोलेजन धो लें.
- Streptavidin लेपित superparamagnetic मोती (1 माइक्रोन मोती = 2 μg -1 एमएल और 2.8 माइक्रोन मोती = 20 μg -1 एमएल) और उन्हें 45 मिनट के लिए कोलेजन अणुओं की अनुमति देते हैं. जोड़ें 1 माइक्रोन मोती को पीबीएस में वांछित एकाग्रता के लिए पतला होना चाहिए. 3 माइक्रोन मोती मजबूत मैग्नेट, तो पीबीएस में resolubilized का उपयोग कर समाधान से अलग किया जाना चाहिए. इस प्रक्रिया में 3 बार दोहराया जाना चाहिए. हमने देखा है कि इस कदम जीई के लिए आवश्यक है3 माइक्रोन मोती सतह स्थिर कोलेजन पेप्टाइड करने के लिए बाध्य करने के लिए टी.
4. Proteolysis परख बल
- एक बार प्रवाह सेल कोलेजन पेप्टाइड और चुंबकीय मोतियों के साथ इकट्ठा किया है, चुंबकीय जाल में कम ~ 1 पी.एन. बल के तहत प्रवाह सेल छवि है. हमारे अनुभव में, मोतियों की एक subpopulation कभी कभी कमजोर है एक गैर विशिष्ट फैशन में सतह से पालन. मामूली बल के आवेदन सुनिश्चित करता है कि इन मोतियों को मुक्त कर रहे हैं.
- प्रवाह सेल को सक्रिय एंजाइम जोड़ें. इस मामले में एमएमपी-1 3.5 मिमी APMA (एसीटेट 4 - aminophenylmercuric के) जोड़ने और 3 घंटे के लिए 37 ° C में incubated रहे पूर्व सक्रिय है. सक्रियण एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर सत्यापित किया गया था.
- जैसे ही प्रवाह सेल चुंबकीय चिमटी तंत्र में फिर से शुरू की, एक वीडियो देखने के कुछ क्षेत्रों में फैले रिकॉर्ड है, आमतौर पर कई सौ संलग्न मोती उपज. यह t = 0 हो जाएगा.
- जबकि टी लौटने देखने के कई क्षेत्रों की रिकॉर्डिंग का एक ही प्रक्रिया (दोहराएँदेखने का एक ही नियमित समय अंक पर) क्षेत्र ओ, जब तक अलग मोती या आगे नहीं proteolysis से discernable है.
- काइनेटिक डेटा विश्लेषण
- देखने के विभिन्न क्षेत्रों में मोती अलग अलग समय बिंदुओं पर और उन्हें गिनती औसत. T = 0 पर मोतियों की संख्या से हर समय बिंदु पर मोतियों की औसत संख्या विभाजित करके मोतियों की संख्या के मानक के अनुसार. यह सुनिश्चित करता है कि हम विभिन्न प्रयोगों से proteolysis की दरों की तुलना कर सकते हैं, क्योंकि मोतियों की निरपेक्ष संख्या के प्रयोग से प्रयोग करने के लिए अलग होगा.
- समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट अनुपात. इस मामले में, हम यह एक घातीय क्षय प्लस एक स्थिर फिट.
जहां ƒ (टी) संलग्न (या कोलेजन अणुओं unproteolyzed) मोती का अनुपात है, टी समय है, एक एक कोलेजन पगहा द्वारा संलग्न मोती का अंश है, ख क्षय की दर स्थिर है, और गमोती है कि गैर - विशेष रूप से जुड़े होते हैं अंश है.- बल और MMP-1 सांद्रता अलग एमएमपी-1 द्वारा कोलेजन proteolysis पर बल का प्रभाव स्पष्ट ही प्रयोग दोहराया है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
ऊपर प्रोटोकॉल एंजाइमी proteolysis पर बल के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक चुंबकीय चिमटी (चित्रा 1) उपन्यास उपयोग का वर्णन करता है. हम 1 माइक्रोन और 3 माइक्रोन मोती दोनों मनाया ब्राउनियन उतार चढ़ाव के परिमाण और रोल बंद आवृत्ति की गणना अलग चुंबक पदों (चित्रा 2) का उपयोग करने के लिए चिमटी कैलिब्रेटेड. बल proteolysis प्रयोगों में, सेटअप है कि डीएनए कोलेजन (3 आंकड़े, 4) के साथ बदल दिया है के अलावा समान है. शेष मोतियों की सामान्यीकृत संख्या proteolysis दर (चित्रा 5) को खोजने के लिए समय के समारोह के रूप में साजिश रची जा सकता है, और इस प्रक्रिया किया जा सकता हैएंजाइम सांद्रता और बलों को अलग करने के लिए दोहराया है.
चित्रा 1 चुंबकीय जाल अंशांकन प्रक्रिया के योजनाबद्ध (पैमाने पर नहीं). दो स्थायी दुर्लभ पृथ्वी मैग्नेट कि superparamagnetic मनका पर खींचती एक चुंबकीय क्षेत्र पैदा करते हैं. चुंबक ऊपर और नीचे अनुवाद लागू शक्ति को समायोजित कर देता है. मोती दो मैग्नेट के बीच एक pinhole के माध्यम से प्रकाश पासिंग के साथ एक पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग imaged किया इनसेट: छवि एक 40x हवा उद्देश्य के साथ लिया. तेज, गोल धब्बे को coverslip सतह से जुड़ी मोतियों के अनुरूप. बाहर फोकस वस्तुओं के अलग मोती हैं.
चित्रा 2 नमूना सतह से चुंबक दूरी के एक समारोह के रूप में एक माइक्रोन (बाएं) और 2.8 माइक्रोन (दाएं) मनका के लिए कैलिब्रेटेड बल का भूखंड है.है. डेटा अनुभवजन्य समारोह के लिए फिट किया गया 
, जहाँ x चुंबक से दूरी है. एक 31.8 = ख = 5.61, और c = 1 माइक्रोन मोती और के लिए 4.39 = 140, ख = 3.10 और 3 माइक्रोन मोती के लिए ग = 1.86. इन मूल्यों को हमारे विशेष साधन और प्रयोगात्मक ज्यामिति के लिए विशिष्ट हैं, और प्रत्येक साधन व्यक्तिगत रूप से calibrated किया जा चाहिए. प्रत्येक बिंदु पर त्रुटि पट्टियाँ मनका मनका आधार पर लागू बल में ~ 10% परिवर्तनशीलता, मोती आकार में परिवर्तनशीलता के कारण का प्रतिनिधित्व करते हैं. लागू बल मोतियों की मात्रा करने के लिए आनुपातिक है, और मनका मात्रा ~ मतलब से अधिक 9% बदलता है (निर्माता विनिर्देशों के अनुसार).
चित्रा सेना 3. Proteolysis परख सेटअप (पैमाने पर करने के लिए नहीं). कोलेजन मॉडल trimer मीटर के माध्यम से coverslip की सतह से जुड़ा हुआ हैYC / विरोधी myc विकार. streptavidin लेपित superparamagnetic मोती बायोटिन-streptavidin लिंकेज के माध्यम से कोलेजन trimers से जुड़े होते हैं. सक्रिय - एमएमपी 1 समय पर कोलेजन कटौती, मोती सतह से अलग करने के लिए और फोकल हवाई जहाज़ से दूर ले जाने के कारण.
चित्रा 4 proteolysis के समय के एक समारोह के रूप में योजनाबद्ध कार्टून. कार्टून का पता चलता है समय पर proteolysis के रूप में देखने का एक नमूना क्षेत्र होता है. समय के साथ, MMP-1 कोलेजन कटौती और मोती अलग और चुंबकीय क्षेत्र के प्रभाव के तहत फोकल हवाई जहाज़ से दूर चाल.
5 चित्रा. Proteolysis दर लागू बल 16 पर निर्भर करते हैं. , 6.2 पी.एन. (3 माइक्रोन एमएमपी-1, लाल) और 13 (0.2 माइक्रोन एमएमपी-1 पी.एन., दाना, दिखाया 1.0 (काला 3 माइक्रोन एमएमपी 1) पी.एन. में एकत्र आंकड़ों हैं) NTA. proteolysis (फिट मापदंडों) की दर: 0.22 ± 0.02 -1 मिनट (पी.एन. 1), 0.46 ± 0.09 मिनट -1 (6.2 पीएन), और 2.08 ± 0.18 मिनट -1 (13 पी.एन.). लंबे समय अंक (15 मिनट) पर unproteolyzed मोती के अंश ~ विभिन्न प्रयोगों में भर में 0.25 पर लगभग स्थिर बनी हुई है. त्रुटि पट्टियाँ को पॉसों हर समय बिंदु पर टिप्पणियों की संख्या को दर्शाती आँकड़े अनुरूप. n मोतियों के लिए हर समय बिंदु पर त्रुटि n 1/2 है. संलग्न मोती के अंश में त्रुटि त्रुटि द्वारा की गणना की गई माइक्रोन propagation.1 मोती 1.0 पी.एन. और 6.2 पी.एन. प्रयोगों और 2.8 माइक्रोन मोती 13 पी.एन. प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया के लिए इस्तेमाल किया गया.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल का एक शास्त्रीय एकल अणु तकनीक के लिए एक नया प्रयोग का वर्णन करता है. चुंबकीय चिमटी उच्च throughput एक लागत प्रभावी तरीके में एक अणु assays के लिए मध्यम अनुमति देते हैं. हालांकि, सभी प्रयोगात्मक तकनीक की तरह वहाँ चुनौतियों और संभावित नुकसान कर रहे हैं.
चुंबकीय चिमटी की सीमाएं
एक मीट्रिक टन तंत्र के स्थानिक और लौकिक संकल्प एक ऑप्टिकल जाल की तुलना में कम है. इसके अलावा, सरल यहाँ वर्णित मीट्रिक टन द्वारा उत्पन्न बलों 30 पी.एन. या कम, नियमित AFM प्रयोगों में पहुँचा बलों की तुलना में काफी कम हैं. यह सीमा एक गुण हो सकता है: मीट्रिक टन ही उप पी.एन. बलों को लागू करने के लिए अनुकूल हैं.
एक ऑप्टिकल जाल या AFM, यहाँ तंत्र के रूप में पारंपरिक मीट्रिक टन, के विपरीत, व्यक्तिगत कणों में हेरफेर की अनुमति नहीं है. ऑप्टिकल जाल आम तौर पर, जबकि मीट्रिक टन ऊर्ध्वाधर खींच प्रयोगों के लिए सबसे अच्छा अनुकूल coverslip करने के लिए समानांतर बल लागू किया जाता है. Electromagneघरेलू मीट्रिक टन इन सीमाओं हालांकि वृद्धि की जटिलता की कीमत पर पता.
चिमटी से नोचना अंशांकन
दोनों ब्राउनियन शक्ति और बल अंशांकन के लिए स्पेक्ट्रम विश्लेषण अस्थिरता अपनी सीमाएं हैं. हमने पाया है कि ब्राउनियन अस्थिरता विधि विशेष रूप से कैमरा कलंक के प्रति संवेदनशील है. के रूप में फ्रेम दर में वृद्धि हुई कम जोखिम समय की गणना शक्ति की कमी हुई. अभ्यास में, हम फ्रेम दर में वृद्धि हुई है जब तक ब्राउनियन उतार चढ़ाव से गणना बलों के 10% के भीतर सत्ता स्पेक्ट्रम का उपयोग करने गणना बलों के साथ सहमति व्यक्त की. इसके विपरीत, बिजली स्पेक्ट्रम विश्लेषण कैमरा कलंक के खिलाफ मजबूत है, लेकिन थोड़ा अधिक मुश्किल को लागू करने के लिए है. हम दोनों गणना प्रदर्शन करने के लिए परिणामों की मजबूती के लिए जाँच करने की सलाह देते हैं.
हम मनका आकार और ~ 10% के लागू बल में बदलाव में चुंबकीय कण सामग्री परिणाम में कि बदलाव कृपया ध्यान दें. यह प्रभाव हमारे ही प्रयोग में महत्वपूर्ण नहीं थाहम प्रत्येक माप में मोतियों की सैकड़ों से अधिक औसत के कारण. हालांकि, प्रयोगों है कि प्रत्येक सीमित मनका से अद्वितीय जानकारी निकालने के संभावित एक और अधिक सटीक अंशांकन विधि की आवश्यकता सकता है.
एकल बिंदु संलग्नक को सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण
विशिष्ट, उन्मुख, एकल बिंदु अनुलग्नकों को प्राप्त करने अक्सर एकल अणु पढ़ाई में एक व्यावहारिक चुनौती है. निम्न नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए कोलेजन की विशिष्ट लगाव की पुष्टि की है, और कोलेजन को मोती:
- एक प्रवाह बीएसए साथ passivated सेल केवल मोती जोड़ा गया.
- विरोधी myc, बीएसए साथ passivated और फिर जोडी मोती जोड़ा गया.
- विरोधी myc जोड़ा गया, बीएसए साथ passivated, गैर - biotinylated कोलेजन जोड़ा और फिर मोती जोड़ा.
- बीएसए साथ Passivated, गैर biotinylated कोलेजन और फिर कहा मोतियों जोड़ा.
- बीएसए साथ Passivated, biotinylated कोलेजन और फिर कहा मोती जोड़ा.
- विरोधी myc जोड़ा गया, बीएसए साथ passivated, बायोटिन गयीylated कोलेजन और फिर कहा मोती.
मामलों में 1-5, जहां लगाव श्रृंखला की कुछ घटक जानबूझकर छोड़े गए किया गया था, कहीं से 0 4 मोती देखा गया था देखने के क्षेत्र (80,000 2 माइक्रोन) प्रति प्रवाह सेल से जुड़ी है. केवल 6 मामले में, जहां सभी लगाव moieties मौजूद हैं, हम ~ 30-60 2.8 माइक्रोन मोती और 80-200 1 माइक्रोन सतह से जुड़ी मोती देखा था. proteolysis कैनेटीक्स मनाया पर्याप्त रूप से एक एक घातीय प्लस एक निरंतर अवधि है, जो दृढ़ता से पता चलता है कि वहाँ केवल एक कदम सीमित दर, और इसलिए केवल एक एकल तार द्वारा फिट. निरंतर अवधि की संभावना मोती है कि गैर - विशेष रूप से coverslip से जुड़ी हैं दर्शाता है.
हम एंटीबॉडी और प्रोटीन की सांद्रता है कि हमारी प्रयोग के लिए काम की रिपोर्ट. प्रत्येक घटक के लिए सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच की जानी चाहिए जब एक नया परख के विकास है. BSA हमारे प्रयोग में सतह passivation एजेंट के रूप में अच्छी तरह से काम किया. हालांकि, इस मुलाकातछाबड़ी सभी परिस्थितियों में काम नहीं कर सकते. सतह passivation लिए अन्य प्रोटोकॉल भी सफलता के साथ इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण polyethylene glycol है functionalized गिलास 17 स्लाइड, लिपिड 18 bilayers समर्थित, एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में या कैसिइन शामिल हैं.
डेटा विश्लेषण पर नोट्स
बातचीत बल proteolysis प्रयोगों में, वहाँ हमेशा कुछ गैर विशिष्ट टुकड़ी (विशेष रूप से उच्च 19 बलों पर) गैर सहसंयोजक (जैसे streptavidin बायोटिन) के पृथक्करण के कारण है. हम नहीं एमएमपी-1 सहित विभिन्न एमएमपी 1 सांद्रता, के रूप में वर्णित अधिकारी एट proteolysis को मापने के द्वारा इस घटना के लिए खाते. सभी बलों के लिए विभिन्न एमएमपी-1 सांद्रता में अल. मापने proteolysis हमें Michaelis Menten घटता, जहां उत्प्रेरक दक्षता कश्मीर बिल्ली / एंजाइम की कश्मीर एम की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है. वैकल्पिक रूप से, अगर एंजाइम के विभिन्न सांद्रता इस्तेमाल नहीं कर रहे, हम अनुशंसा करते हैं किएक नियंत्रण माप गैर विशिष्ट टुकड़ी की दर घटाना दिया बलों पर कोई एंजाइम के साथ किया जा.
संभावित अनुप्रयोगों
चुंबकीय चिमटी एक विस्तृत रेंज बल को कवर. exerted है किया जा सकता है कि सेना मोती के आकार पर निर्भर करते हैं. 1 माइक्रोन और सुलभ बलों में 2.8 माइक्रोन मोती, और हमारे अनुभव में ओवरलैप करते हैं, मध्यवर्ती बलों पर मोतियों की भी अच्छी तरह से काम करता है.
हम आशा करते है कि इसी तरह की प्रयोगात्मक दृष्टिकोण बल निर्भर proteolysis 4,20 अध्ययन में मोटे तौर पर लागू हो, 21 और बाध्यकारी 22 बातचीत खुलासा हो सकता है. हम और 23 अन्य लोगों ने कहा है कि विवर्तन के छल्ले के बाहर के लिए ध्यान केंद्रित मोती की त्रिज्या 23 coverslip लिए मनका रिश्तेदार की स्थिति पर नज़र रखने के लिए एक संवेदनशील साधन प्रदान करता है. हालांकि इस तरह से आम तौर पर इस्तेमाल नहीं किया है, हम मानते हैं कि मीट्रिक टन assays नैनोमीटर सटीक meas प्रदान करने के लिए क्षमता हैप्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता की urements. यह अतिरिक्त जानकारी के बल पर निर्भर proteolysis या बाध्यकारी माप के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम में Burroughs Wellcome कैरियर पुरस्कार वैज्ञानिक इंटरफ़ेस (एआरडी), एनआईएच के निदेशक का नया अन्वेषक पुरस्कार कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान 1-DP2 - OD007078 (एआरडी), विलियम Bowes जूनियर स्टैनफोर्ड ग्रेजुएट फैलोशिप (एएसए द्वारा समर्थित किया गया ), और स्टैनफोर्ड हृदय संस्थान छोटी predoctoral फैलोशिप (जेसी). लेखकों जेम्स Spudich माइक्रोस्कोपी उपकरण उधार लिया हुआ धन के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
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