Summary
Dans cet article, nous décrivons l'utilisation de pinces magnétiques pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l'échelle de la molécule unique d'une manière hautement parallélisables.
Abstract
La génération et la détection des forces mécaniques est un aspect omniprésent de la physiologie cellulaire, en rapport direct avec le cancer métastatique 1, 2 et athérogenèse cicatrisation de la plaie 3. Dans chacun de ces exemples, les cellules à la fois exercer une force sur leur environnement et, simultanément, par voie enzymatique de remodeler la matrice extracellulaire (MEC). L'effet des forces sur ECM est donc devenue un domaine d'intérêt considérable en raison de son importance biologique et médicale susceptible 4-7.
Techniques molécules simples telles que le piégeage optique 8, microscopie à force atomique 9, et des pinces magnétiques 10,11 permettre aux chercheurs de sonder la fonction des enzymes au niveau moléculaire en exerçant des forces sur les protéines individuelles. Parmi ces techniques, pinces magnétiques (MT) sont remarquables par leur faible coût et à haut débit. MT exercer des forces dans la gamme de ~ 1-100 pN et peut fournir milliseconde résolution temporelle,qualités qui sont bien adaptés à l'étude du mécanisme enzymatique à la molécule seul niveau 12. Nous rapportons ici un test MT hautement parallélisable pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse de molécules de protéines uniques. Nous présentons l'exemple spécifique de la protéolyse d'un peptide de collagène trimérique par la matrice métalloprotéinase 1 (MMP-1); cependant, ce test peut être facilement adapté à l'étude d'autres substrats et des protéases.
Protocol
1. Préparation des cellules de débit
- Lamelles (# 1.5, 22x22 mm et 22x40 mm, VWR) sont nettoyés à l'aide sonication.
- Ajouter les lamelles d'un petit récipient en verre capable de tenir les lamelles et le montage dans le sonicateur (voir étape 2).
- Remplissez le récipient avec de l'isopropanol et sonifier dans un bain sonique pendant 20 minutes.
- Jeter l'isopropanol et rincer les lamelles avec de grandes quantités d'eau déminéralisée produite par un appareil Barnsted MilliQ ou un dispositif similaire. Remplissez le récipient avec de l'eau et à une sonication pendant 20 minutes.
- Après sonication, sécher les lamelles dans un flux d'eau filtrée, air exempt de poussière. Utilisez seulement des lamelles qui apparaissent propres (c.-à-pas de bavures).
- Doucement la flamme des lamelles pour quelques secondes afin de les nettoyer de toute poussière et l'humidité restante: passer les lamelles à travers une flamme de gaz produite avec un bec Bunsen, en prenant soin de ne pas déformer la lamelle en raison de l'excès de chaleur. Cette étape supprime la surface résiduellecontaminants.
- En utilisant du scotch double face, fixez les deux lamelles ensemble. Couper la bande ~ 3 cm de longueur et 0,3 cm de largeur. Attacher la bande sur la lamelle mm 22x40 laissant un canal 1,6 cm au milieu. Utiliser un embout de pipette pour appuyez doucement sur la lamelle afin de s'assurer que la bande a bien respecté.
2. Configuration magnétique Pince à épiler et d'étalonnage
- Pinces magnétiques ont été installés à l'aide permanents aimants de terres rares comme décrit précédemment 10,12. Un support en L en aluminium a été construit avec un trou d'épingle de 1 mm de diamètre et monté sur une verticale z-traducteur (Thorlabs) pour moduler la hauteur des pinces. Deux permanents de terres rares aimants sont fixés au support de chaque côté du trou d'épingle pour créer le piège magnétique (figure 1).
- Préparation de l'ADN: l'ADN de phage lambda marqué à son extrémité 5 'et 3' extrémités avec de la biotine et la digoxigénine (IDT ADN, San Diego, CA) a été utilisée pour calibrer le magpinces magnétiques.
- Mélanger 50 uL de 4 nM λ-ADN avec 2 pi de 40 nM oligonucléotide conjugué biotine et de la chaleur à 60 ° C pendant 10 minutes. Puis, lentement, laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure.
- Ajouter ligase d'ADN selon les spécifications du fabricant et ligaturer à la température ambiante pendant 3 heures.
- Ajouter 2 ul de 400 nM oligonucléotide digoxigénine conjugué et incuber à température ambiante pendant 45 minutes.
- Ajouter 1,5 pi de 10 mM d'ATP et continuer la ligature de l'oligonucléotide conjugué à la digoxigénine l'ADN-λ pendant 3 heures.
- Retirez les oligonucléotides en excès et la ligase ADN à l'aide de 100 filtres de spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un total de l'échange de tampon de 1000 fois dans du tampon TE est suffisant pour éliminer les oligos excédentaires. Remarque: Il est important de ne pas utiliser des vitesses d'essorage> 500xG parce qu'elle conduira à la tonte de l'ADN.
- Examiner un échantillon de l'ADN par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,7% pour que l'ADN in'est pas dénaturé ou cisaillés.
- Mesurer la concentration de l'ADN. L'utilisation d'un Nanodrop spectromètre UV-Vis (Thermo Scientific) est recommandée car le volume d'échantillon disponible peut être très faible.
- Préparer les cellules de flux tel que décrit dans l'article 1.
- Pour la fixation de l'ADN à la cellule de flux, ajoutez anticorps anti-digoxigénine (IgG de mouton; 1 pg mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Allemagne) et de lui permettre d'adhérer à la surface du verre pendant 15 minutes.
- Passiver la surface de la cellule d'écoulement pour empêcher le collage non spécifique de l'ADN par addition de 2 mg ml de BSA -1, 0,1% de Tween-20 dans du PBS 1x. Incuber à température ambiante pendant 45 minutes.
- Répétez l'étape 2.5.
- Ajouter 50 pM de fuctionalized λ-ADN et permettent d'attacher à la lamelle pendant 15 minutes.
- Laver tout excédant d'ADN avec 1x PBS.
- Ajouter billes superparamagnétiques recouvertes de streptavidine (billes 1 um = 2 pg mL -1; 2,8 um = perles 20 pg ml -1
- Laver excès de billes avec 1x PBS.
- Magnétique d'étalonnage Brucelles
- Déplacer les aimants permanents à une position qui est éloignée de la surface d'échantillon (> 15 mm).
- Placez la cellule d'écoulement préparée dans le microscope.
- Déplacer les aimants permanents en position au-dessus de la cellule d'écoulement.
- Choisissez le plan focal de λ-ADN billes fonctionnalisées en se concentrant sur les perles loin de surfaces de verre les deux. Le plan focale correcte est celui dans lequel les perles ont un centre souhaités lumineuse.
- Prenez une vidéo du mouvement talon à 80 Hz ou plus pour 500 cadres.
- Déplacer l'aimant plus proche de la surface d'échantillon. Pour les distances supérieures de 5 mm, déplacer par incréments de 1 mm. Pour les distances entre 1 et 5 mm, déplacer par incréments de 0,5 mm. Pour les distances inférieures à 1 mm, déplacer par incréments de 0,25 mm.
- Répétez les étapes 2.11.5 et 2.11.6 à chaque position de l'aimant nouvelle.
- Pour chaque ensemble de donnéesdéfinir, suivre le centre des billes en utilisant un ajustement 2D gaussien.
- Calculer la force par l'intermédiaire des fluctuations browniennes en utilisant:
où k B T est l'énergie thermique de Boltzmann, L est la longueur de λ-ADN, et <x 2> est la variance dans la position centroïde.- Confirmez l'exactitude des forces en cochant la calcul de la force par l'intermédiaire d'un ajustement du spectre de puissance de Lorentz afin de trouver la fréquence Atténuation. Force appliquée est liée à la fréquence rolloff par la relation:
Où 0 est la fréquence ƒ rolloff, a est le rayon de talon, et μ est la viscosité du fluide 12.
3. Pièce jointe Peptide de collagène pour Cellules à écoulement
Afin de donner un exemple concret de l'application de notre méthodologie, nous décrivons les travaux récents de notre laboratoire qui caractérise la protéolyse d'un peptide modèle collagène trimérique. Nous prévoyons que cette approche générale peut être largement appliquée à d'autres protéines et polynucléotides.
- Le peptide modèle collagène consiste en une N-terminale 6x His-tag pour la purification, suivie par un code 5x myc, (PPM) de 10 à appliquer formation de triple hélice, le collagène a1 résidus 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), qui forment la MMP- une site de reconnaissance, la séquence foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), et un KKCK C-terminale de faciliter le marquage avec la biotine-maléimide. Foldon dérive de la protéine T4 fibritin-phage, et stabilise trimères modèle de collagène lorsqu'il est fondu à l'extrémité N - ou C-terminale 13,14.
- Le peptide de collagène et de MMP-1 protéines ont été exprimées et purifiées comme décrit précédemment 4,15. </ Li>
- Ajouter anti-myc (15 ug mL -1) à la cellule d'écoulement et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre à l'anti-myc à joindre à la surface de la cellule d'écoulement.
- Passiver la cellule d'écoulement afin de prévenir de fixation non spécifique de protéines en utilisant 5 mg ml -1 BSA de la même manière que décrit dans l'étape 2.5.
- Ajouter 150 peptide de collagène pM et lui permettre de joindre à l'anticorps par l'intermédiaire du tag myc pendant 45 minutes.
- Laver excès de collagène à l'aide du tampon PBS.
- Ajouter des billes de streptavidine superparamagnétiques revêtu (1 perles um = 2 pg mL -1 et 2,8 um = perles 20 pg mL -1) et de leur permettre de se fixer aux molécules de collagène pendant 45 minutes. Les perles de 1 um doit être dilué à la concentration souhaitée dans du PBS. Les 3 perles um doit être séparé de la solution en utilisant des aimants puissants, alors en solution dans du PBS. Ce processus doit être répété 3 fois. Nous avons remarqué que cette étape est essentielle pour GEt les 3 perles um de se lier à la surface immobilisée peptide de collagène.
4. Essai protéolyse vigueur
- Une fois la cellule de flux est assemblé avec le peptide de collagène et des billes magnétiques, l'image de la cellule de flux dans le piège magnétique sous peu, ~ 1 pN vigueur. Dans notre expérience, une sous-population des perles est parfois faiblement collée à la surface d'une manière non-spécifique. L'application de la force modeste veille à ce que ces perles sont libérés.
- Ajouter une enzyme activée à la cellule d'écoulement. Dans ce cas, MMP-1 a été pré-activée en ajoutant 3,5 mM APMA (4-aminophénylmercurique acétate) et incubées à 37 ° C pendant 3 heures. L'activation a été vérifiée par SDS-PAGE.
- Dès que la cellule de flux est ré-introduit dans l'appareil magnétique pince à épiler, enregistrer une vidéo couvrant quelques champs de vue, généralement céder plusieurs centaines de perles attachées. Ce sera t = 0.
- Répétez le même processus d'enregistrement de plusieurs champs de vue (alors qu'il rentrait to le même champ de vision) en des points de temps réguliers, jusqu'à ce que toutes les perles se détachent ou pas encore protéolyse est perceptible.
- Kinetic analyse des données
- Compter les perles dans les différents domaines de vue à différents moments et de les moyenner. Normaliser le nombre de billes en divisant le nombre moyen de billes à chaque point temporel par le nombre de billes à l'instant t = 0. Cela garantit que nous pouvons comparer les taux de protéolyse à partir d'expériences différentes, parce que le nombre absolu de perles sera différent d'une expérience à.
- Tracer le rapport en tant que fonction du temps. Dans ce cas, nous l'avons monté sur une décroissance exponentielle plus une constante.
où f (t) est le rapport des perles attachées (ou les molécules de collagène unproteolyzed), t est le temps, a est la fraction de billes attachés par une attache collagène, b est le taux de décroissance constante, et cest la fraction de billes qui sont attachés de manière non spécifique.- La même expérience est répétée à force variable et les concentrations de MMP-1 pour élucider l'effet de la force sur la protéolyse du collagène par la MMP-1.
5. Les résultats représentatifs
Le protocole ci-dessus décrit une nouvelle utilisation de pinces magnétiques (Figure 1) pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique. Nous calibré la pince à épiler pour 1 pm et 3 perles um utilisant à la fois l'ampleur des fluctuations observées browniens et le calcul de la fréquence roll-off à des positions différentes aimant (Figure 2). Dans les expériences de protéolyse de force, la configuration est similaire, sauf que l'ADN est remplacé par du collagène (figures 3, 4). Le nombre normalisé de billes restantes peuvent être tracées en fonction du temps pour trouver les taux de protéolyse (Figure 5), et ce processus peut êtrerépétée pour différentes concentrations d'enzymes et des forces.
Figure 1. Schéma du processus d'étalonnage piège magnétique (pas à l'échelle). Deux aimants permanents de terres rares créer un champ magnétique qui tire sur le bourrelet superparamagnétique. Traduire l'aimant de haut en bas permet de régler la force appliquée. Les perles sont imagées en utilisant un classique champ lumineux microscope avec la lumière qui traverse un trou d'épingle entre les deux aimants Encart:. Image prise avec un objectif 40x air. Les tranchants, des points ronds correspondent aux billes attachés à la surface de lamelle. Les objets out-of-discussion sont des perles détachées.
Figure 2. Graphiques de force calibrée en fonction de la distance aimant de la surface d'échantillon de 1 pm (gauche) et 2,8 microns (droite) de talons. Les données ont été ajustées à la fonction empirique 
, Où x est la distance entre l'aimant. Une = 31,8, b = 5,61, et c = 4,39 pour les billes 1 um et une = 140, b = 3,10 et c = 1,86 pour les bourrelets 3 um. Ces valeurs sont spécifiques à notre instrument spécifique et de la géométrie expérimentale, et chaque instrument doit être étalonné individuellement. Les barres d'erreur à chaque point représentent une variabilité ~ 10% en force appliquée sur un bourrelet à base de talon, en raison de la variabilité de la taille des billes. La force appliquée est proportionnelle au volume des perles, et le volume varie bourrelet ~ 9% par rapport à la moyenne (selon les spécifications du fabricant).
Figure 3. Configuration dosage force la protéolyse (Pas à l'échelle). Le modèle de trimère collagène est fixée à la surface de la lamelle intermédiaire myc / anti-myc conjugaison. Les billes revêtues de streptavidine superparamagnétiques sont attachés à des trimères de collagène par une liaison biotine-streptavidine. Activé MMP-1 coupes du collagène dans le temps, provoquant les billes de se détacher de la surface et de s'éloigner du plan focal.
Figure 4. Dessin schématique d'une protéolyse en fonction du temps. La caricature montre un champ de l'échantillon de vue au fil du temps que la protéolyse se produit. Au fil du temps, MMP-1 coupe le collagène et les perles se détacher et de s'éloigner du plan focal, sous l'influence du champ magnétique.
Taux de protéolyse Figure 5. Dépendent force appliquée 16. Montré sont données recueillies à 1,0 pN (3 uM MMP-1, noir), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rouge) et 13 pN (0,2 uM MMP-1; magenta). Les taux de protéolyse (paramètres de l'ajustement) sont les suivantes: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 pN), et 2,08 ± 0,18 min -1 (13 pN). La fraction de perles unproteolyzed à des moments longs (> 15 minutes) reste à peu près constante à ~ 0,25 travers différentes expériences. Les barres d'erreur correspondent à la statistique de Poisson, reflétant le nombre d'observations à chaque instant. L'erreur à chaque point temporel pour les billes n est le n 1/2. L'erreur dans la fraction de perles attachées a été calculé par erreur propagation.1 perles um ont été utilisées pour 1,0 et 6,2 pN pN expériences et 2,8 um perles ont été utilisés pour des expériences pN 13.
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Discussion
Ce protocole décrit une nouvelle utilisation d'une technique seule molécule classique. Pinces magnétiques permettent à moyen et à haut débit des tests de molécules simples d'une manière rentable. Cependant, comme toutes les techniques expérimentales il ya des défis et les pièges potentiels.
Limitations de pinces magnétiques
Par rapport à un piège optique de la résolution spatiale et temporelle d'un appareil de MT est faible. En outre, les forces générées par le MT simple décrite ici sont de 30 pN ou moins, beaucoup moins que les forces systématiquement accessibles dans les expériences de l'AFM. Cette limitation peut être une vertu: MT sont bien adaptés pour l'application de la sous-pN forces.
Contrairement à un piège optique ou AFM, MT classique, tel que l'appareil ici, ne permettent pas la manipulation de particules individuelles. Pièges optiques sont généralement utilisés pour appliquer une force parallèle à la lamelle, tandis que MT sont les mieux adaptés pour les applications verticales expériences de traction. Electromagnetic MT remédier à ces limitations, mais au prix d'une complexité accrue.
Calibration des brucelles
Tant la fluctuation brownien et l'analyse du spectre de puissance pour l'étalonnage en force ont leurs limites. Nous avons constaté que la méthode des fluctuations brownien est particulièrement sensible aux flou caméra. Comme le taux de trame augmenté (diminué le temps d'exposition), la force calculée diminué. Dans la pratique, nous avons augmenté cadence jusqu'à ce que les forces calculées à partir des fluctuations browniennes d'accord avec les forces calculées en utilisant le spectre de puissance pour moins de 10%. A l'inverse, l'analyse du spectre de puissance est plus robuste contre la caméra flou, mais un peu plus difficile à mettre en œuvre. Nous vous recommandons d'effectuer les deux calculs pour vérifier la robustesse des résultats.
Nous notons que les variations de taille des billes et magnétique résultat teneur en particules dans les variations de la force appliquée de ~ 10%. Cet effet n'est pas important dans notre expérience récente seraparce que nous en moyenne sur des centaines de billes dans chaque mesure. Cependant, des expériences qui extraient des informations uniques de chaque captif cordon pourrait exiger une méthode d'étalonnage plus précis.
Contrôles pour s'assurer que les pièces jointes à point unique
Atteindre spécifiques, orientés, en un seul point des pièces jointes est souvent un défi pratique dans les études de molécules simples. Les contrôles suivants ont confirmé l'attachement particulier de collagène à l'anticorps, et des perles au collagène:
- Ajouté perles seulement à une cellule d'écoulement passivé avec de la BSA.
- Ajouté anti-myc, perles passivées avec de la BSA et ensuite ajouté.
- Ajouté anti-myc, passivé avec de la BSA, a ajouté non-biotinylé collagène et ensuite ajouté des perles.
- Passivé avec de la BSA, a ajouté non-biotinylé collagène et de perles, puis ajoutées.
- Passivé avec de la BSA, a ajouté le collagène biotinylé et de perles, puis ajoutées.
- Ajouté anti-myc, passivé avec de la BSA, a ajouté la biotinecollagène ylated et de perles, puis ajoutées.
Dans les cas 1-5, où certains composants de la série l'attachement a été délibérément omise, n'importe où de 0 à 4 billes ont été vu attaché à la cellule d'écoulement par champ de vue (80.000 um 2). Seulement dans le cas 6, où tous les fragments de fixation sont présents, avons-nous vu de ~ 30-60 2,8 um et perles perles 80-200 1 um attachés à la surface. Les cinétiques de protéolyse observée sont suffisamment apte par une exponentielle simple et un terme constant, ce qui suggère fortement qu'il n'y a qu'une seule étape limitant la vitesse, et donc seulement une attache unique. Le terme constant reflète probablement des perles qui sont non-spécifiquement attaché à la lamelle.
Nous rapportons les concentrations d'anticorps et de protéines qui ont travaillé pour notre expérience. Une large gamme de concentrations pour chaque composant doit être examinée lors de l'élaboration d'une nouvelle épreuve. BSA a bien fonctionné comme un agent de passivation de surface dans notre expérience. Cependant, cette rencontrehod peut ne pas fonctionner en toutes circonstances. D'autres protocoles pour la passivation de surface ont également été utilisées avec succès. Exemples comprennent polyéthylène glycol lames de verre fonctionnalisés 17, bicouches lipidiques supportées 18, ou la caséine comme agent de blocage.
Notes sur l'analyse des données
Dans les expériences de protéolyse de force, il ya toujours un certain détachement non-spécifique (en particulier à des forces supérieures 19) en raison de la dissociation de la non-covalentes (par exemple la biotine - streptavidine) interactions. Nous expliquer ce phénomène par la mesure de la protéolyse à différents MMP-1, y compris les concentrations ne MMP-1, tels que décrits dans Adhikari et al. al. protéolyse de mesure à différentes concentrations de MMP-1 pour toutes les forces nous permet de générer des courbes de Michaelis-Menten, où sont utilisées pour calculer l'efficacité catalytique k cat / K M de l'enzyme. Par ailleurs, si différentes concentrations de l'enzyme ne sont pas utilisés, nous recommandons queune mesure de contrôle se faire sans enzyme à des forces données pour soustraire hors du taux de non-spécifique détachement.
Les applications potentielles
Les pinces magnétiques couvrent un large éventail de force. Les forces qui peuvent être exercées dépendent de la taille des billes. 1 um et 2,8 um perles se chevauchent dans les forces accessibles, et dans notre expérience, en utilisant soit des billes à des forces intermédiaires fonctionne bien.
Nous prévoyons que similaires approches expérimentales peuvent être largement applicable dans l'étude de la protéolyse dépendante vigueur 4,20, se déroule les 21 et les interactions de liaison 22. Nous et d'autres 23 ont noté que le rayon des anneaux de diffraction pour de perles de discussion fournit un moyen sensible pour le suivi de la position relative de l'bourrelet à la lamelle 23. Bien que généralement pas utilisé de cette façon, nous croyons que les dosages ont MT la capacité de fournir du nanomètre précision mesuresurements de la dynamique des protéines structurelles. Cette information supplémentaire peut être particulièrement utile dans le contexte de la force la protéolyse dépendante ou des mesures contraignantes.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Prix de carrière Burroughs Wellcome à l'interface scientifique (ARD), le National Institutes of Health à travers le directeur du NIH Programme Innovateur Prix Nouveau 1-DP2-OD007078 (ARD), le William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), et le Stanford Cardiovascular Institute Jeune bourse pré-doctorale (JC). Les auteurs tiennent à remercier James pour le prêt Spudich équipement de microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
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