Summary
एक उपन्यास प्रतिदीप्ति
Protocol
1. नमूना स्लाइड तैयारी
- OctoChrome मछली सहित मानव कोशिकाओं, मेटाफ़ेज़ फैलता में गुणसूत्र में परिवर्तन की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है लेकिन सुसंस्कृत परिधीय रक्त कोशिकाओं, स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और सेल लाइनों के लिए सीमित नहीं है. नमूने metaphases 3,11-13 कटाई के लिए मानक प्रक्रिया के बाद तैयार किया जाना चाहिए: द्वारा मेटाफ़ेज़, hypotonic उपचार में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए कोशिकाओं को प्रफुल्लित colcemid उपचार रोजगार, और Carnoy निलंबन में 0.5-1 लगभग x 10 6 कोशिकाओं में कोशिकाओं को ठीक लगानेवाला मिलीग्राम प्रति.
- 2 मिनट के लिए शुद्ध इथेनॉल में सूई से साफ: 8 वर्ग स्लाइड 803, PMP Cytocell लिमिटेड, कैंब्रिज, ब्रिटेन, चित्रा 2 OctoChrome किट, # सूचीपत्र में प्रदान करें.
- नमूना स्लाइड बनाने से पहले, एक स्लाइड पर कोशिकाओं की एक छोटी राशि ड्रॉप करने के लिए सेल घनत्व की जाँच करें. यदि सेल घनत्व उच्च (भी कई अतिव्यापी कोशिकाओं) भी है, ताजा लगानेवाला साथ निलंबन पतला. यदि सेल घनत्व बहुत कम है (बहुत कुछ सेलस्लाइड पर), कोशिकाओं नीचे स्पिन और ताजा लगानेवाला की एक छोटी मात्रा में फिर से निलंबित. 2/8 - 3/5/6 4 विंदुक 1/7 वर्ग बारी के एक दृश्य में टेम्पलेट स्लाइड के 8 क्षेत्रों में से प्रत्येक पर सेल निलंबन की 5-10 μl. एक बार पहले दो चौकों हवा सूखे है, एक ही तरीके में शेष वर्गों हाजिर. यह एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप से सेल फैलता को रोकने है.
- सूखे स्लाइड संकरण से पहले से अधिक 5 साल के लिए -20 ° नाइट्रोजन वातावरण में सी में संग्रहीत किया जा सकता है.
2. एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग metaphases का स्थानीयकरण
- स्लाइड का प्रत्येक आधे के केंद्र के लिए 4 के 20 μl ',6-diamidino-2 phenylindole (0.2 μg / एमएल) लागू करते हैं और फिर एक coverslip साथ कवर.
- नमूना स्लाइड के एक स्वचालित स्कैन करने के लिए मेटाफ़ेज़ Metafer सॉफ्टवेयर है (MetaSystems, Altlussheim, जर्मनी) का उपयोग कर कक्षों का स्थानीयकरण हो. यह सभी metaphases और भविष्य सभी सेल छवियों का फिर से मूल्यांकन के स्थान की सुविधा.
- स्कैनिंग परिणाम मैन्युअल देखें और गैर - मेटाफ़ेज़ कलाकृतियों को हटा दें.
3. संकरण
- नमूना स्लाइड और OctoChrome डिवाइस के तैयार
- 30 मिनट दूर DAPI धोने के लिए नमूना स्लाइड 2x एसएससी बफर में कमरे के तापमान पर डुबकी.
- इथेनॉल washes के (70% में 2 मिनट, 85% और 100% इथेनॉल) की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूना स्लाइड निर्जलीकरण, सूखी और एक ° 5 मिनट के लिए hotplate सी 37 पर जगह की अनुमति.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में Chromoprobe Multiprobe संकरण चैंबर (OctoChrome किट में दिए गए) और 37 से संतुलित करना प्लेस की अनुमति डिग्री सेल्सियस (+ / - 1 डिग्री सेल्सियस).
- दोहराया और प्रति OctoChrome युक्ति पूर्व गर्म 25 μl अशेष भाजक pipetting द्वारा 37 सी. ° करने के लिए मिश्रण संकरण समाधान (OctoChrome किट में) प्रदान
- पूर्व गर्म प्रत्येक OctoChrome युक्ति ° युक्ति लेबल की ओर एक hotplate पर नीचे रखकर सी 37 (OctoChrome किट में प्रदान की, चित्र 2 देखें). छू नहींउभरा OctoChrome डिवाइस के सतहों के रूप में वे जांच के होते हैं.
- OctoChrome डिवाइस पर नमूना स्लाइड स्थिति निर्धारण (चित्रा 2)
- पूर्व गर्म OctoChrome डिवाइस पर आठ क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए पूर्व गर्म संकरण समाधान के 2 μl जोड़ें जबकि यह 37 पर रहता डिग्री सेल्सियस
- OctoChrome है कि इस तरह के नंबर 1 है, जो अब उल्टा OctoChrome डिवाइस के ऊपरी दाएँ हाथ के क्षेत्र पर स्थित है डिवाइस पर ध्यान टेम्पलेट स्लाइड पलटना. 1 वर्ग का पता लगाने में मदद करने के लिए, डिवाइस पर अपनी स्थिति ऑरेंज में चिह्नित किया गया है.
- सुनिश्चित करें कि टेम्पलेट स्लाइड ध्यान OctoChrome डिवाइस पर मिलान क्षेत्रों के साथ गठबंधन किया है. ध्यान से OctoChrome युक्ति से अधिक स्लाइड कम इतना है कि संकरण समाधान की बूँदें स्लाइड के साथ संपर्क बनाने के लिए. कोमल लागू करें, भी करने के लिए सुनिश्चित करें कि संकरण समाधान OctoChrome डिवाइस पर उठाया क्षेत्रों में से प्रत्येक के किनारों को फैला हुआ है दबाव.
- लिफ्टस्लाइड / OctoChrome, ध्यान पाले सेओढ़ लिया गिलास स्लाइड के अंत पकड़ है, और इतना पलटना कि स्लाइड युक्ति नीचे OctoChrome है. सुनिश्चित करें कि युक्ति धब्बा टेम्पलेट स्लाइड पार नहीं करता है के रूप में इस जांच के पार संदूषण के कारण सकता है.
- पर जगह 37 डिग्री सेल्सियस (+ / - 1 डिग्री सेल्सियस) 10 मिनट के लिए hotplate.
- विकृतीकरण
- नमूना स्लाइड / OctoChrome युक्ति hotplate विशेष देखभाल लेने के लिए यह स्तर पकड़ करने के लिए स्थानांतरण. नमूना स्लाइड में समान रूप से hotplate संपर्क सुनिश्चित करें.
- Hotplate पर 75 denature डिग्री सेल्सियस (+ / - 1 डिग्री सेल्सियस) 5 मिनट के लिए.
- संकरण
- जगह नमूना / Chromoprobe Multiprobe संकरण चैंबर में OctoChrome युक्ति स्लाइड.
- ढक्कन बदलें और 37 में कक्ष नाव डिग्री सेल्सियस (+ / - 1 डिग्री सेल्सियस) पानी स्नान (गैर - क्रियाशीलता) रातोंरात. कृपया ध्यान दें: संकरण कक्ष पर सील ढक्कन नहीं है, पानी के स्नान पर मुहर नहीं ढक्कन, एक में संकरण नहींइनक्यूबेटर. इन चरणों नमी को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
- पोस्ट - संकरण washes
- धोने के समाधान की तैयारी
हल: 1 / Coplin Hellendahl 0.4x एसएससी युक्त जार तैयार. 72 से संतुलित करना ° C (+ / - 1 डिग्री सेल्सियस) एक नहाने के पानी में और 7.0 पीएच को समायोजित.
समाधान 2: / Coplin Hellendahl 2x एसएससी और 0.05% के बीच 20 से युक्त जार तैयार. कमरे के तापमान पर खड़े करने की अनुमति दें. - OctoChrome डिवाइस ध्यान से स्लाइड से निकालें और 2 मिनट के लिए समाधान 1 स्लाइड जगह.
- समाधान 2 में 30 सेकंड के लिए स्लाइड रखें.
4. बढ़ते और परिणाम के दृश्य
- DAPI की स्लाइड का प्रत्येक आधे के केंद्र के लिए 20 μl लागू करें और एक coverslip लागू.
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखने से पहले कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
Figuफिर 3A 2 स्क्वायर में एक सामान्य मेटाफ़ेज़ सेल से पता चलता है. (1) - (3): 8 गुणसूत्रों, 21 और 12 लाल, हरे, और नीले रंग में रंगा गया था, और एक टेक्सास लाल, FITC, और DEAC फिल्टर, क्रमशः के माध्यम से कल्पना की जाती है, (4): एक DAPI / / FITC के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन टेक्सास लाल ट्रिपल फिल्टर. आम तौर पर, गुणसूत्रों नीले रंग के साथ चित्रित ट्रिपल फिल्टर के माध्यम से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं और लिए विशिष्ट DEAC फिल्टर के तहत देखा जा जरूरत है.
चित्रा 3B लेकिमिया विशिष्ट गुणसूत्र स्थानान्तरण और aneuploidy के साथ प्रतिनिधि असामान्य कोशिकाओं को दर्शाता है. (1): टी (8, 21), तीव्र myeloid लेकिमिया में एक आम गुणसूत्र स्थानान्तरण, (2): 21 Trisomy, 21 गुणसूत्र, लेकिमिया में एक आम aneuploidy की तीन प्रतियां.
चित्रा 1 OctoChrome डिवाइस और उम्मीद गुणसूत्र चित्रकला परिणाम पर गुणसूत्र संयोजन की व्यवस्था.
![चित्रा 2]("Files/ftp_upload/3619/3619fig2.jpg)
चित्रा 2 OctoChrome डिवाइस पर नमूना स्लाइड के पोजिशनिंग.
चित्रा 3 प्रतिनिधि परिणाम.OctoChrome मछली (2 स्क्वायर) से प्राप्त है.
चित्रा 3A 8 गुणसूत्रों, 12, 21 2 स्क्वायर में चित्रित के साथ एक सामान्य कोशिका.
चित्रा 3B. लेकिमिया विशिष्ट गुणसूत्र और 2 स्क्वायर में स्थानान्तरण aneuploidy के साथ प्रतिनिधि असामान्य कोशिकाओं.
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Discussion
यह उपन्यास परख OctoChrome मछली के साथ ही एक स्लाइड पर एक संकरण में सभी 24 मानव गुणसूत्रों की जांच करने के लिए अनुमति देता है. 8 वर्गों पर गुणसूत्र संयोजन की व्यवस्था के लिए सबसे आम ल्यूकेमिया और lymphomas में गैर यादृच्छिक गुणसूत्र rearrangements की पहचान की सुविधा के लिए बनाया गया है. इस प्रकार, परख (aneuploidy) संख्यात्मक रूप में के रूप में अच्छी तरह से संरचनात्मक (ट्रांसलोकेशन) गुणसूत्र परिवर्तन समवर्ती का पता लगा सकते हैं.
इस परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम नहाने के पानी में चल कक्ष में रात में संकरण के दौरान नमी को नियंत्रित करना है. मछली और जांच संकरण बफर को आसानी से बाहर सूखी अगर नमी कम है, या बन भी बहुत अधिक नमी को अवशोषित कर पतला अगर नमी ज्यादा है. या तो परिणाम पर प्रतिकूल परिणाम पर प्रभाव पड़ सकता है. इस चुनौती पर काबू पाने के लिए एक संभव संशोधन के लिए टेप के साथ OctoChrome युक्ति और नमूना स्लाइड सील और एक 37 ° पर संकरणअंधेरे रात में सी hotplate.
नमूना स्लाइड है कि बहुत अधिक आयु वर्ग के है यह सीधे परख में उपयोग के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. जबकि पेप्सिन साथ इस तरह के नमूने पचाने संकरण में सुधार करने के लिए, एक नाइट्रोजन वातावरण में -20 में तैयार नमूना स्लाइड भंडारण डिग्री सेल्सियस दृढ़ता से उम्र बढ़ने कम से कम की सिफारिश की है.
OctoChrome मछली ल्यूकेमिया और लिम्फोमा के नैदानिक निदान के लिए एक आशाजनक तकनीक है. यह भी सबसे विशिष्ट गुणसूत्र rearrangements संभावित leukemogens और lymphomagens उजागर करने के लिए आबादी में और aneuploidy एक गुणसूत्र व्यापक तरीके में रसायनों के उत्प्रेरण प्रभावों के अध्ययन के लिए मानव ल्यूकेमिया और लिम्फोमा के लिए संबंधित जांच के लिए बहुत उपयोगी है. हमारे पिछले CWAS इस तकनीक का उपयोग अध्ययन दिखा दिया कि कुछ क्रोमोसोम अधिक 8,10 बेंजीन, एक प्राथमिक औद्योगिक रसायन और एक देशव्यापी पर्यावरणीय प्रदूषक कि मानव लेकिमिया 14 का कारण बनता है के लिए जोखिम से दूसरों की तुलना में प्रभावित हो सकता है.अन्य रासायनिक CWAS का उपयोग कर जोखिम में "चयनात्मक aneuploidy" की इस घटना का पता लगाया जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों गंभीर पढ़ने और पांडुलिपि संपादन के लिए डॉ. Cliona एम. McHale धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01ES017452 के एल जांग संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
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