Generazione di culture Raft organotipiche da cheratinociti umani primari

Summary

Un<em> In vitro</em> Metodo per imitare<em> In vivo</em> Differenziazione epiteliale è descritto. Molti virus bersaglio le cellule epiteliali, come parte del loro ciclo vitale del virus, e questo metodo fornisce un mezzo di esaminare virus: interazioni host che più assomiglia quella che si verifica<em> In vivo</em>. Questa tecnica può essere utilizzata con cheratinociti primari, linee cellulari stabilizzate, nonché normale o tessuti malati biopsia.

Abstract

Lo sviluppo di culture organotipiche zattera epiteliali ha fornito ai ricercatori un efficiente sistema in vitro, che riassume fedelmente la differenziazione epiteliale. Ci sono molti usi per questo sistema. Ad esempio, la capacità di crescere colture tridimensionali zattera organotipiche di cheratinociti è un passo importante nello studio di papillomavirus umano (HPV) ^1. Il ciclo di vita di HPV è strettamente legata alla differenziazione dell'epitelio squamoso ^2. Organotipiche culture zattera epiteliali, come dimostrato qui riprodurre l'intero ciclo di vita papillomavirus, compresa la produzione di virus ^3,4,5. In aggiunta, queste culture zattera presentano lesioni displastiche simili a quelli osservati al momento in vivo con infezione da HPV. Quindi questo sistema può anche essere usato per studiare il cancro delle cellule epiteliali, nonché l'effetto dei farmaci sulla differenziazione delle cellule epiteliali in generale. Originariamente sviluppato da Asselineau e Prunieras <sup> 6 e modificato da Kopan et al. ^7, il sistema di coltura organotipica epiteliale zattera è maturato in generale, modello di coltura relativamente facile, che coinvolge la crescita di cellule su collagene tappi mantenuta al di interfaccia aria-liquido (Figura 1A). Nel corso di 10-14 giorni, le cellule stratificare e differenziare, formando un epitelio pieno spessore che produce la differenziazione-specifica citocheratine. Zattere raccolto può essere esaminato istologicamente, nonché mediante tecniche standard molecolari e biochimiche. In questo articolo, si descrive un metodo per la generazione di colture zattera da cheratinociti umani primari. La stessa tecnica può essere utilizzata con linee cellulari epiteliali, e può essere facilmente adattato per l'utilizzo con il tessuto epiteliale da biopsie normali o malati ^8. Molti virus bersaglio sia l'epitelio cutaneo o delle mucose, come parte del loro ciclo replicativo di vita. Nel corso degli ultimi anni, la possibilità di utilizzare cult zattera organotipicaURES come un metodo di studio virus-ospite interazioni cellulari è stato dimostrato per herpesvirus diverse, così come adenovirus, parvovirus, e poxvirus ^9. Culture zattera organotipiche può quindi essere adattato per esaminare patogenesi virale, e sono gli unici mezzi per testare nuovi agenti antivirali per quei virus che non sono coltivabili in linee cellulari permanenti.

Protocol

1. Preparazione Culture Raft organotipiche Le griglie metalliche zattera molto prima essere trattata con acido cromico solforico per rimuovere eventuali residui che potrebbero interferire con il processo di differenziazione. Griglie metalliche immergere in un bicchiere di vetro contenente acido solforico per un'ora, quindi risciacquati in continuo per tutta la notte con acqua di rubinetto. Dopo il risciacquo durante la notte, griglie zattera devono essere risciacquati per 3-5 ore in acqua bidistillata. </…

Discussion

Descriviamo qui un metodo che può essere usato per studiare differenziazione epiteliale in generale, ma può anche essere facilmente adattato per studiare la patogenesi virale, come pure l'efficacia della terapia potenziali. Molti virus bersaglio le cellule epiteliali sia come sito primario di infezione, come nel caso di HPV, o ad un certo punto nel ciclo vitale del virus, come con herpesvirus. Sebbene in crescita culture zattera organotipiche richiede molto tempo, la capacità di ricapitolare fedelmente in viv…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog number
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010