Generación de las Culturas Raft organotípicos de queratinocitos humanos primarios

Summary

Un<em> In vitro</em> Método para imitar<em> En vivo</emLa diferenciación> epitelial se ha descrito. Muchos virus dirigirse a las células epiteliales como parte de su ciclo de vida del virus, y este método proporciona una manera de examinar el virus: las interacciones del huésped que se asemeja más a lo que ocurre<em> En vivo</em>. Esta técnica se puede utilizar con queratinocitos primarios, líneas celulares establecidas, así como biopsia de tejido normal o enfermo.

Abstract

El desarrollo de las culturas organotípicos balsa epiteliales ha proporcionado a los investigadores con un eficiente sistema in vitro que fielmente recapitula la diferenciación epitelial. Hay muchos usos para este sistema. Por ejemplo, la capacidad de crecer cultivos tridimensionales balsa organotípicos de queratinocitos ha sido un hito importante en el estudio de los virus del papiloma humano (VPH) ^1. El ciclo de vida del HPV está estrechamente vinculada a la diferenciación del epitelio escamoso ^2. Organotípicos culturas balsa epiteliales como se ha demostrado aquí reproducir el ciclo de vida completo del virus del papiloma, incluidos los virus de la producción ^3,4,5. Además, estos cultivos presentan lesiones displásicas balsas similares a los observados en la infección in vivo con el VPH. Por tanto, este sistema también puede utilizarse para estudiar los cánceres de células epiteliales, así como el efecto de fármacos sobre la diferenciación de células epiteliales en general. Originalmente desarrollado por Asselineau y Prunieras <shasta> 6 y modificado por Kopan et al. ^7, el sistema organotípico epitelial cultivo en balsas ha madurado en un modelo general, la cultura relativamente fácil, que implica el crecimiento de células sobre el colágeno se enchufa mantuvo a una interfase aire-líquido (Figura 1A). Durante el curso de 10-14 días, las células estratificar y diferenciar, formando un epitelio de grosor completo que produce específicos diferenciación-citoqueratinas. Balsas cosechadas se pueden examinar histológicamente, así como por las técnicas estándar de moleculares y bioquímicos. En este artículo, se describe un método para la generación de cultivos primarios balsa de queratinocitos humanos. La misma técnica se puede utilizar con las líneas celulares establecidas epiteliales, y puede ser fácilmente adaptado para su uso con el tejido epitelial de biopsias normales o enfermas ^8. Muchos virus objetivo, ya sea el epitelio cutáneo o mucoso, como parte de su ciclo de vida replicativa. En los últimos años, la posibilidad de utilizar culto balsa organotípicoUres como un método de estudio de virus-huésped interacciones celulares se ha demostrado por varios herpesvirus, así como adenovirus, parvovirus, y poxvirus ^9. Cultivos organotípicos balsa por lo tanto se puede adaptar para examinar la patogénesis viral, y son el único medio para poner a prueba nuevos agentes antivirales para los virus que no son cultivables en líneas celulares permanentes.

Protocol

1. Preparación para las Culturas Raft organotípicos Las rejillas balsa de metal mucho primero se trata con ácido crómico sulfúrico para eliminar cualquier residuo que pudiera interferir con el proceso de diferenciación. Sumergir rejillas metálicas en un vaso de precipitados de vidrio que contenía ácido sulfúrico durante una hora, a continuación, de forma continua durante la noche enjuaga con agua del grifo. Después de la noche a la mañana enjuague, las redes de balsas debe enjuagarse durante 3-5 …

Discussion

Se describe aquí un método que puede utilizarse para estudiar la diferenciación epitelial en general, pero también puede ser fácilmente adaptado para estudiar la patogénesis viral, así como la eficacia de la terapéutica potencial. Muchos virus orientar las células epiteliales, ya sea como el sitio primario de la infección, como en el caso de VPH, o en algún punto del ciclo de vida viral, como con herpesvirus. Aunque cada vez más cultivos organotípicos balsa es mucho tiempo, la capacidad de hacer una recapit…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog number
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010