Summary
La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.
Abstract
Después de su liberación en la hendidura sináptica de dopamina, ejerce sus propiedades biológicas a través de sus objetivos pre y post sináptica-1. La señal de la dopamina se termina por difusión 2-3, enzimas extracelulares 4, y transportadores de membrana 5. El transportador de la dopamina, que se encuentra en la hendidura peri-sináptica de las neuronas de dopamina despeja las aminas liberadas a través de un flujo de dopamina hacia adentro (absorción). El transportador de la dopamina también puede funcionar en sentido inverso para liberar aminas del interior al exterior en un proceso llamado transporte hacia el exterior o flujo de salida de la dopamina 5. . Hace más de 20 años atrás Sulzer et al informaron el transportador de dopamina puede funcionar en dos modos de actuación: avance (absorción) y marcha atrás (flujo de salida) 5. El neurotransmisor liberado a través de flujo de salida a través del transportador puede mover una gran cantidad de dopamina en el espacio extracelular, y se ha demostrado que desempeñan un papel regulador importante en dopamina extracelular homeostasis 6. Aquí se describe cómo patch clamp y la grabación simultáneas amperometría se puede utilizar para medir la dopamina liberada mediante el mecanismo de eflujo con resolución de tiempo de milisegundos cuando el potencial de membrana se controla. Por esto, su conjunto de células actuales y oxidativa (amperométrico) señales se miden simultáneamente utilizando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, con un conjunto de paso bajo del filtro de Bessel a 1.000 Hz para células enteras de grabación actual). Para amperometría grabación de un electrodo de fibra de carbono está conectado a un segundo amplificador (Axopatch 200B) y se coloca adyacente a la membrana plasmática y se mantuvo a +700 mV. Las células enteras y oxidativa (amperométrico) corrientes puede ser grabado y la actual relación de tensión puede ser generada utilizando un protocolo de paso de tensión. A diferencia de la calibración habitual amperométrica, que requiere la conversión a concentración, la corriente se comunica directamente sin tener en cuenta el volumen efectivo 7. Así, los datos resultantesrepresentan un límite inferior para el eflujo de dopamina porque algunos transmisor se pierde a la solución a granel.
Protocol
1. Equipos y Suministros
- Montar una jaula de Faraday en la parte superior de la mesa de vibración anti (TMI) para disminuir el ruido de fondo.
- La abrazadera simultánea parche amperometría sistema de grabación necesita un microscopio invertido con excelentes óptica DIC y una larga distancia de trabajo de la lente. Conecte el microscopio faro a una batería de coche. Esta fuente de luz de CC para el sistema disminuirá aún más el ruido eléctrico.
- Micromanipuladores hidráulicas (Siskiyou) nueva disminución de ruido. En nuestra configuración, se utiliza un manipulador diestro para la grabación de célula entera, y el zurdo de amperometría.
2. Preparar Electrodos para grabación
- Tire de electrodos de conexión utilizando pipetas de cuarzo en un extractor P-2000 (Sutter). Nuestra tracción dura aproximadamente 5 segundos, con dos ciclos de calor. Esta vez, el calor ha dado lugar a una resistencia consistente (3-4 mW) en nuestros pipetas de células enteras patch.
- Llenar el electrodo con lapipeta solución que contiene 2 mM de dopamina y montarlo en el manipulador derecha. Envolver el recipiente que contiene la solución de la pipeta que contiene DA con papel de aluminio. Mantenga en hielo. La dopamina es oxidable. Manteniendo la solución en hielo, protegidos de la luz disminuirá la tasa de oxidación de la dopamina.
- Retire suavemente un ProCFE (Dagan) de carbono bajo ruido electrodo amperométrico de fibra de la caja de almacenamiento, llenar con mercurio, montaje sobre el adaptador amperométrica (como se representa en la Figura 1) y, a continuación, montar en el maniupulator derecho. Proteger el extremo de la fibra de carbono de daño al sujetar el extremo de la fibra de carbono. Inspeccionar el electrodo con un microscopio de laboratorio para asegurarse de que la punta esté limpio e intacto.
- Examinar la integridad del electrodo amperométrico por poner el electrodo en un fondo del plato Petri de vidrio que contiene la solución externa. Grabar una corriente de línea de base en la ausencia de dopamina. Añadir 10 l de una solución 1 mM de DA al plato. Una re bueno electrodo amperométricocables de un aumento en la corriente oxidativo. Repita este paso en el inicio y el final de cada experimento para asegurarse de que el electrodo amperométrico funciona correctamente.
3. Preparar el cultivo primario de neuronas de dopamina neuronal o Células modificadas genéticamente para expresar transportador de dopamina en placas de Petri de vidrio de fondo
- Lave suavemente las células o neuronas de dopamina tres veces con solución externa caliente.
- Monte el plato de Petri con fondo de cristal en la platina del microscopio.
4. Visualice la célula y realizar Experiment
- Encuentre el punto focal correcta para visualizar claramente las celdas. Coloque presión positiva en el electrodo de parche. Entonces, pase suavemente hacia abajo ambos electrodos en la solución, y cerca de la célula.
- Coloque el electrodo amperométrico próximo a la célula (en el lado izquierdo), y el electrodo de parche a la derecha.
- Alcanzar un sello gigaohmio en la celda con el electrodo de parche. La rotura del sello con succión alograr la configuración de células enteras.
- Permitir 5-8 min para la diálisis de la solución interna que contiene la dopamina en la célula.
- Utilice paso deseado de tensión o de protocolo de rampa. Simultáneamente adquirir datos de que la pipeta del parche y el electrodo amperométrico para medir las corrientes de células enteras y el transporte inverso de la dopamina a través del transportador de la dopamina, mientras que el potencial de membrana se controla a través de la pipeta de parche.
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Representative Results
Patch clamp combinada con amperometría puede medir el voltaje dependiente de DAT mediada por flujo de salida de DA. Figura 2A muestra una configuración representativa experimental y grabación de DAT mediada por flujo de salida de DA cuando el medio intracelular y el potencial de membrana se sujeta mediante una pipeta zonal de célula completa. Usando esta técnica, las células que expresan YFP-DAT proteínas tienen tensión fijada con una pipeta de células patch entero mientras que un electrodo amperométrico se coloca sobre la membrana plasmática (Figura 2A). El electrodo de célula entera se llena con una solución de la pipeta que contiene 2 mM DA. El electrodo amperométrico tocar la membrana plasmática se mantiene a 700 mV, un potencial mayor que el potencial redox de DA. DAT mediada por las corrientes de células enteras (-Figura 2C y 2D amperométrica-la figura) se registran mediante la intensificación de la pipeta de células enteras a un voltaje de la membrana entre -60 y 100 mV desde un potencial de mantenimiento de -40 mV (Figura 2B la Figura 2D) en las corrientes amperométricos corresponde a un flujo hacia el exterior de DA. Traslado de la fibra de carbono de distancia del parche hace que la respuesta oxidativa a ser más pequeños y más lento. Como era de esperar para la oxidación de DA, la respuesta oxidativa disminuye cuando la tensión de la fibra de carbono se reduce a +300 mV y desaparecerá por completo en una reducción mayor. Figura 2E-2F son representativos de grabaciones aceptables e inaceptables. Figura 2E es un ejemplo de un GΩ apretado células enteras sello y la señal amperométrica correspondiente. Figura 2F representaciónts una fuga de células enteras patch. La grabación correspondiente amperométrico mide filtrado DA.
Figura 1. Preparación y montaje de electrodo amperométrico. Retire con cuidado un ProCFE carbono bajo ruido electrodo amperométrico fibra de la caja de almacenaje, llenado con mercurio. Prepare el adaptador enroscando el alambre de plata en el soporte de patch clamp, luego enrosque el adaptador en el soporte de patch clamp y suavemente montar el electrodo amperométrico. La punta de la fibra de carbono no debe tocar nada.
Figura 2. Registro representativo de células enteras y amperométrica en múltiples voltajes cuando el parche pipeta está en configuración de célula completa. (A) de dibujos animados que ilustra la configuración experimental.Las células que expresan el transportador de dopamina fueron tensión fijada con una pipeta zonal de célula completa, mientras que un electrodo amperométrico se colocó cerca de la membrana celular. La oxidación de los resultados de DA en una corriente amperométrica positivo. (B) Imagen de fijación de voltaje protocolo de forma de onda. (C) DAT mediada por las corrientes registradas por la intensificación de la tensión de la membrana entre -60 y +100 mV desde un potencial de mantenimiento de -40 mV con la pipeta de células enteras. La solución de la pipeta contenía 2 mM de dopamina, como se ha descrito previamente 7-9. (D) La corriente amperométrica adquiridas simultáneamente con la corriente de célula entera representada en el panel C (arriba). Al inicio de la etapa de voltaje, para voltajes mayores de +20 mV, los registros de los electrodos amperométricos de una corriente de oxidación (positivo), que aumentó durante toda la duración de la etapa de voltaje. (E) y (F) son representativas de aceptables e inaceptables de células enteras experimentos de patch clamp, respectivamente. Figura 2E es un ejemplo de un apretado w GΩagujero de células sello y la señal amperométrica correspondiente. Figura 2F representa una fuga de células enteras patch. La resistencia del sello alcanzado el rango mW en lugar de GΩ antes o después de romper en la célula para conseguir el modo de célula entera. La grabación amperomtric correspondientes medidas filtrado DA. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
Simultánea de fijación de voltaje y amperometría tiene las siguientes ventajas. Todos los tipos de células son accesibles y se pueden utilizar para la grabación. La identificación de las células o neuronas donde las grabaciones son realizadas es sencilla y directa. En particular, si la celda está marcada con fluorescencia mediante la adición de una etiqueta fluorescente para la proteína de interés, el experimentador puede seleccionar fácilmente la célula diana o neurona. La configuración experimental permite un suministro uniforme y controlada de agentes farmacológicos ya sea a través de la pipeta de parche, o por adición de estos agentes a la solución del baño 10. La abrazadera simultánea parche amperometría técnica permite la investigación de la función de los diferentes canales y transportadores en la liberación del transmisor oxidable con resolución de tiempo de milisegundos, mientras que la membrana potencial es controlado. La misma información no se puede obtener a través de métodos bioquímicos 8. Uno de los aspectos únicos de esta approach es que permite la manipulación del ambiente intracelular por diálisis a través de la pipeta de parche 7,11. Sin embargo, esta técnica tiene la desventaja de que el electrodo amperométrico sólo puede detectar transmisores oxidables. Además, la sensibilidad del electrodo amperométrico disminuye en presencia de sustancial liberación basal y espontáneo de un compuesto oxidable, por lo que la medición de la liberación después de, por ejemplo, la precarga de un compuesto oxidable que está liberado espontáneamente se puede producir una disminución en la oxidativo actual. La principal desventaja de esta técnica es el requisito de conocimientos técnicos y equipo costoso.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Sanika Chirwa para la revisión crítica de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (DA026947, DA021471 y NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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