טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

Summary

כאן אנו מתארים את השימוש של הרכבה עצמית 3 ממדי הפיגום לתרבות תאים אנושיים אבי עצביים. אנו מציגים פרוטוקול לשחרר את התאים מן הפיגומים כדי להיות מנותח למשל לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה עשוי להתאים סוגי תאים אחרים לבצע מחקרים מפורטים באופן מכניסטי.

Abstract

ההשפעה של 3 ממדי (3D) פיגומים על בידול, צמיחה שגשוג עצבי ולבסוף הוא עניין רב כדי למצוא שיטות חדשות עבור טיפולים מבוססי תאים סטנדרטיים ב הפרעות נוירולוגיות או מחלות ניווניות. 3D מבנים צפויים לספק סביבה הרבה יותר קרוב במצב vivo מאשר תרבויות 2D. בהקשר של רפואה רגנרטיבית, השילוב של פיגומים ביולוגי עם גזע עצביים ועל ובתאים טומן בחובו הבטחה גדולה ככלי טיפולי. ^1-5 במערכות התרבות חיקוי סביבת תלת מימדי הוכחו להשפיע על התרבות והתמיינות בסוגים שונים של גזע ובתאים. בזאת, היווצרות של functionalisation microenviroment-3D חשוב כדי לקבוע את הישרדות גורלם של תאים מוטבע. ^6-8 כאן השתמשנו PuraMatrix ^9,10 (RADA16, AM), הידרוג פפטיד פיגום מבוסס,אשר מתואר היטב בשימוש ללמוד את השפעת הסביבה-3D על תאים מסוגים שונים. ^7,11-14 PuraMatrix יכול להיות מותאם אישית בקלות את ייצור סינתטי של סיבים ננו מספק מערכת 3D-התרבות של אמינות גבוהה, אשר בנוסף קסנו חינם.

לאחרונה יש לנו חקר את ההשפעה של ריכוז PM על היווצרות של הפיגום. ¹³ במחקר זה נעשה שימוש בריכוזים של ראש הממשלה הייתה השפעה ישירה על היווצרות של מבנה-3D, אשר הודגם על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. ניתוח בדיעבד של הישרדות והבחנה של hNPCs גילה השפעה של הריכוזים של שימוש PM על גורלם של תאים מוטבע. עם זאת, ניתוח של הישרדות או בידול העצבית באמצעות טכניקות posses immunofluorescence כמה משוכות. כדי לקבל נתונים אמינים, יש לקבוע את המספר הכולל של תאים בתוך מטריצה ​​להשיג את המספר היחסי של למשל. תאים עצביים בסימן טובולין-βIII. זה תנאים מוקדמים טכניקה לנתח את הפיגומים בכל 3 מימדים על ידי מיקרוסקופ confocal או טכניקה דומה כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסוגל לקחת Z-ערימות של הדגימה. יתר על כן סוג זה של ניתוח היא מאוד זמן רב.

כאן אנו להדגים שיטה לשחרר את התאים מן 3D-פיגומים למשל את הניתוח מאוחר יותר על ידי cytometry הזרימה. בפרוטוקול זה אנושי ובתאים עצביים (hNPCs) של הקו הסלולרי ReNcell VM (Millipore ארה"ב) היו תרבותי מובחן ב-3D פיגומים המורכב PuraMatrix (PM) או PuraMatrix בתוספת laminin (PML). בידיים שלנו PM-ריכוז של 0.25% היה אופטימלי לגידול של ¹³ תאים, לעומת זאת ריכוז יכול להיות מותאם סוגי תאים אחרים. ¹² התאים שפורסמו ניתן להשתמש ללימודי immunocytochemical למשל ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. הדבר מאיץ את הניתוח מושוב ושוב, את שאר הנתונים המתקבלים על בסיס רחב יותר, לשפר את אמינות הנתונים.

Protocol

1. חלק 1: תרבות hNPCs ב PuraMatrix לקראת לדור של פיגום עם ריכוז PuraMatrix של 0.25% ללא laminin אחד צריך להכין את הפתרונות הבאים הכן תמיסה המכילה 20% סוכרוז ו תמיסה המכילה 10% סוכרוז מומס במים מזוקקים סטריליים. <li…

Discussion

השימוש ב-3D ​​פיגומים מציעה את ההזדמנות ללמוד על התפתחות תאים מסוגים שונים במצב תרבית תאים קרובים יותר במצב vivo. עם זאת, לגבי ניתוח של התמיינות נוירונים למשל או מחקרים פונקציונלי יש צורך להתגבר על כמה מכשולים כדי לקבל נתונים מהימנים על כימות למשל של סוגי תאים.

<p…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
PuraMatrix peptide hydrogel	BD Bioscience	354250
Mouse laminin I	Cultrex	400-2009090
Sucrose	Sigma	S9378-1KG
Normal goat serum	Dako	X0907
Triton X 100	Roth	3051.3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	Gibco	14170-088	Hanks’ Balanced Salt Solution 1X
βIII-tubulin antibody	Santa Cruz	Sc-51670	Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	Goat α mouse, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2,780-2	1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98%
Cell strainer	BD Biosciences	352350	70 μm pore size
Saponin	Merck	7695
Trypsin/ EDTA	GIBCO	25300-054
Benzonase 250 U/μl	Merck	1.01654.0001
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	Human-Albumin Kabi 20%