Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Summary

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Abstract

De invloed van de 3-dimensionale (3D) steigers op de groei, proliferatie en tenslotte neuronale differentiatie is van groot belang om nieuwe methoden te vinden voor cel-gebaseerde en gestandaardiseerde therapieën in neurologische aandoeningen of neurodegeneratieve ziekten. 3D-structuren wordt verwacht dat zij een omgeving te bieden veel dichter bij de in vivo situatie dan 2D-culturen. In het kader van de regeneratieve geneeskunde, de combinatie van biomateriaal steigers met neurale stamcellen en stamcellen is veelbelovend als een therapeutisch instrument. ^1-5 Cultuur systemen emuleert een drie dimensionale omgeving is aangetoond dat de proliferatie en differentiatie invloed in verschillende types van stengel en progenitorcellen. Hierin de vorming en functionalisering van de 3D-microenviroment is belangrijk om te bepalen het overleven en het lot van de ingesloten cellen. ^6-8 Hier gebruikten we PuraMatrix ^9,10 (RADA16, PM), een peptide op basis van hydrogel schavot,die goed wordt beschreven en gebruikt om de invloed van een 3D-omgeving op verschillende celtypen te bestuderen. ^7,11-14 PuraMatrix kan eenvoudig worden aangepast en de synthetische fabricage van de nano-vezels zorgt voor een 3D-cultuur systeem van hoge betrouwbaarheid, die is in aanvulling xeno-vrij.

Onlangs hebben we bestudeerden de invloed van de PM-concentratie op de vorming van het schavot. ¹³ In deze studie de gebruikte concentraties van PM had een directe invloed op de vorming van de 3D-structuur, die werd gedemonstreerd door atomaire kracht microscopie. Een volgende analyse van de overleving en differentiatie van de hNPCs onthulde een invloed van de gebruikte concentraties van PM over het lot van de ingesloten cellen. Echter, de analyse van de overleving of de neuronale differentiatie door middel van immunofluorescentie technieken bezitten een aantal hindernissen. Te winnen betrouwbare gegevens, moet men het totaal aantal cellen te bepalen binnen een matrix om het relatieve aantal van bijvoorbeeld het verkrijgen. neuronale cellen gekenmerkt door βIII-tubuline. Deze voorwaarden een techniek om de steigers in alle drie dimensies analyseren door een confocale microscoop of een vergelijkbare techniek als fluorescentie microscopen in staat om z-stacks van het monster te nemen. Bovendien is deze vorm van analyse is zeer tijdrovend.

Hier laten we zien een methode om cellen van de 3D-steigers release voor de latere analyse, bijvoorbeeld door flowcytometrie. In dit protocol menselijke neurale stamcellen (hNPCs) van de ReNcell VM cellijn (Millipore USA) werden gekweekt en gedifferentieerde in 3D-steigers bestaande uit PuraMatrix (PM) of PuraMatrix aangevuld met laminine (PML). In onze handen een PM-concentratie van 0,25% was optimaal voor de teelt van de cellen ^13, maar de concentratie zou kunnen worden aangepast aan andere soorten cellen. ¹² De vrijgekomen cellen kunnen worden gebruikt voor bijvoorbeeld immunocytochemische studies en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Dit versnelt de analyse en de moopnieuw over, de verkregen gegevens rusten op een bredere basis, het verbeteren van de betrouwbaarheid van de gegevens.

Protocol

1. Deel 1: Cultuur van hNPCs in PuraMatrix Vooraf aan de generatie van een steiger met een PuraMatrix concentratie van 0,25% zonder laminine moet men de voorbereiding van de volgende oplossingen Bereid een oplossing met 20% sucrose en een oplossing van 10% sucrose opgelost in steriel gedistilleerd water. Voor oplossing een mix 120 ul van de 20% sucrose-oplossing met 120 ul van gedistilleerd water in een 1,5 ml conische buis. Voor oplossing 2 mix 60 pl van de PuraMatrix oplossing …

Discussion

Het gebruik van 3D-scaffolds biedt de mogelijkheid om de ontwikkeling van verschillende celtypes studie in een celkweek situatie dichter bij de in vivo situatie. Echter, met betrekking tot de analyse van bijvoorbeeld neuronale differentiatie of functionele studies men moet een aantal obstakels overwinnen om betrouwbare gegevens voor bijvoorbeeld de kwantificering van celtypen te krijgen.

Hier beschrijven we de cultuur van hNPCs in het peptide hydrogel op basis van steiger PuraMatrix…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
PuraMatrix peptide hydrogel	BD Bioscience	354250
Mouse laminin I	Cultrex	400-2009090
Sucrose	Sigma	S9378-1KG
Normal goat serum	Dako	X0907
Triton X 100	Roth	3051.3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	Gibco	14170-088	Hanks’ Balanced Salt Solution 1X
βIII-tubulin antibody	Santa Cruz	Sc-51670	Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	Goat α mouse, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2,780-2	1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98%
Cell strainer	BD Biosciences	352350	70 μm pore size
Saponin	Merck	7695
Trypsin/ EDTA	GIBCO	25300-054
Benzonase 250 U/μl	Merck	1.01654.0001
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	Human-Albumin Kabi 20%