Summary

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Published: January 11, 2012
doi:

Summary

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Abstract

De invloed van de 3-dimensionale (3D) steigers op de groei, proliferatie en tenslotte neuronale differentiatie is van groot belang om nieuwe methoden te vinden voor cel-gebaseerde en gestandaardiseerde therapieën in neurologische aandoeningen of neurodegeneratieve ziekten. 3D-structuren wordt verwacht dat zij een omgeving te bieden veel dichter bij de in vivo situatie dan 2D-culturen. In het kader van de regeneratieve geneeskunde, de combinatie van biomateriaal steigers met neurale stamcellen en stamcellen is veelbelovend als een therapeutisch instrument. 1-5 Cultuur systemen emuleert een drie dimensionale omgeving is aangetoond dat de proliferatie en differentiatie invloed in verschillende types van stengel en progenitorcellen. Hierin de vorming en functionalisering van de 3D-microenviroment is belangrijk om te bepalen het overleven en het lot van de ingesloten cellen. 6-8 Hier gebruikten we PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), een peptide op basis van hydrogel schavot,die goed wordt beschreven en gebruikt om de invloed van een 3D-omgeving op verschillende celtypen te bestuderen. 7,11-14 PuraMatrix kan eenvoudig worden aangepast en de synthetische fabricage van de nano-vezels zorgt voor een 3D-cultuur systeem van hoge betrouwbaarheid, die is in aanvulling xeno-vrij.

Onlangs hebben we bestudeerden de invloed van de PM-concentratie op de vorming van het schavot. 13 In deze studie de gebruikte concentraties van PM had een directe invloed op de vorming van de 3D-structuur, die werd gedemonstreerd door atomaire kracht microscopie. Een volgende analyse van de overleving en differentiatie van de hNPCs onthulde een invloed van de gebruikte concentraties van PM over het lot van de ingesloten cellen. Echter, de analyse van de overleving of de neuronale differentiatie door middel van immunofluorescentie technieken bezitten een aantal hindernissen. Te winnen betrouwbare gegevens, moet men het totaal aantal cellen te bepalen binnen een matrix om het relatieve aantal van bijvoorbeeld het verkrijgen. neuronale cellen gekenmerkt door βIII-tubuline. Deze voorwaarden een techniek om de steigers in alle drie dimensies analyseren door een confocale microscoop of een vergelijkbare techniek als fluorescentie microscopen in staat om z-stacks van het monster te nemen. Bovendien is deze vorm van analyse is zeer tijdrovend.

Hier laten we zien een methode om cellen van de 3D-steigers release voor de latere analyse, bijvoorbeeld door flowcytometrie. In dit protocol menselijke neurale stamcellen (hNPCs) van de ReNcell VM cellijn (Millipore USA) werden gekweekt en gedifferentieerde in 3D-steigers bestaande uit PuraMatrix (PM) of PuraMatrix aangevuld met laminine (PML). In onze handen een PM-concentratie van 0,25% was optimaal voor de teelt van de cellen 13, maar de concentratie zou kunnen worden aangepast aan andere soorten cellen. 12 De vrijgekomen cellen kunnen worden gebruikt voor bijvoorbeeld immunocytochemische studies en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Dit versnelt de analyse en de moopnieuw over, de verkregen gegevens rusten op een bredere basis, het verbeteren van de betrouwbaarheid van de gegevens.

Protocol

1. Deel 1: Cultuur van hNPCs in PuraMatrix Vooraf aan de generatie van een steiger met een PuraMatrix concentratie van 0,25% zonder laminine moet men de voorbereiding van de volgende oplossingen Bereid een oplossing met 20% sucrose en een oplossing van 10% sucrose opgelost in steriel gedistilleerd water. Voor oplossing een mix 120 ul van de 20% sucrose-oplossing met 120 ul van gedistilleerd water in een 1,5 ml conische buis. Voor oplossing 2 mix 60 pl van de PuraMatrix oplossing …

Discussion

Het gebruik van 3D-scaffolds biedt de mogelijkheid om de ontwikkeling van verschillende celtypes studie in een celkweek situatie dichter bij de in vivo situatie. Echter, met betrekking tot de analyse van bijvoorbeeld neuronale differentiatie of functionele studies men moet een aantal obstakels overwinnen om betrouwbare gegevens voor bijvoorbeeld de kwantificering van celtypen te krijgen.

Hier beschrijven we de cultuur van hNPCs in het peptide hydrogel op basis van steiger PuraMatrix…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Norman Krüger bedanken voor zijn uitstekende technische ondersteuning.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
PuraMatrix peptide hydrogel BD Bioscience 354250  
Mouse laminin I Cultrex 400-2009090  
Sucrose Sigma S9378-1KG  
Normal goat serum Dako X0907  
Triton X 100 Roth 3051.3  
PBS Dulbecco Biochrom AG L 1825  
HBSS Gibco 14170-088 Hanks’ Balanced Salt Solution 1X
βIII-tubulin antibody Santa Cruz Sc-51670 Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488 Invitrogen A 11029 Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568 Invitrogen A 11031 Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647 Invitrogen A 21235 Goat α mouse, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent Calbiochem 475904  
Dabco Aldrich D2,780-2 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98%
Cell strainer BD Biosciences 352350 70 μm pore size
Saponin Merck 7695  
Trypsin/ EDTA GIBCO 25300-054  
Benzonase 250 U/μl Merck 1.01654.0001  
Trypsin Inhibitor Sigma T6522 (500 mg)  
20% HSA Octapharma Human-Albumin Kabi 20%  

References

  1. Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
  2. Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
  3. Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
  4. Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
  5. Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
  6. Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
  7. Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
  8. Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
  9. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
  10. Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
  11. Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
  12. Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
  13. Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
  14. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
  15. Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
  16. Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
  17. Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
  18. PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).

Play Video

Cite This Article
Liedmann, A., Rolfs, A., Frech, M. J. Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel. J. Vis. Exp. (59), e3830, doi:10.3791/3830 (2012).

View Video